La producción de antraquinonas por cultivo in vitro de células y tejidos vegetales de Rubia tinctorum: Modelo para la enseñanza de bioprocesos en cursos Biotecnología de Plantas

CARDILLO, ALEJANDRA BEATRIZ; CEREZO, JULIETA; BUSTO, VICTOR; MINOIA, JUAN MAURICIO; JORDI, CELINA; QUEVEDO, CARLA; RIVIÈRE, STÉPHANIE; MARTINEZ, CAROLINA; SMITH, MARÍA EMILIA; GIULIETTI, ANA MARIA; RODRIGUEZ TALOU, JULIAN; PERASSOLO, MARÍA

Congreso; 5° SAPROBIO - Simposio Argentino de Bioprocesos; 2018

IntroducciónEl cultivo in vitro de células y tejidos vegetales para la producción de metabolitos secundarios y proteínas es una realidad en la Industria Biotecnológica. En el marco del curso de posgrado en Biotecnología Vegetal de la Maestría en Biotecnología (UBA) se diseñó un trabajo práctico con el objetivo que los alumnos comprendan las diferentes estrategias para optimizar estos bioprocesos.Como modelo se emplea cultivos de suspensiones celulares y raíces transformadas de Rubia tinctorum productoras de antraquinonas (AQs).Rubia tinctorum es una especie perteneciente al género Rubiaceae que produce distintos tipos de metabolitos secundarios, siendo las antraquinonas los más importantes de todos ellos. Varias especies que contienen estos compuestos han sido empleadas tradicionalmente con fines medicinales (Samuelsson 1999). Las AQs, además de ser empleadas como colorantes por la industria, pueden tener un uso potencial en la industria de los alimentos debido a su resistencia a distintos agentes físicos como la luz y la temperatura (Han et al 2001). La estructura química base de estos metabolitos secundarios es la 9,10-antraquinona (9,10-dioxoantraceno), que puede ser sustituida de diversas maneras, generando una gran variedad de estructuras. Por otra parte, las AQs se extraen en forma rápida del tejido vegetal y se pueden determinar en forma sencilla por espectrofotometría.Los objetivos que nos planteamos en el diseño de este Trabajo Práctico son:Que el alumno adquiera las herramientas para realizar cultivo en batch de suspensiones y raíces de R. tinctorum. Además, que pueda monitorear y analizar una curva de crecimiento estimando los parámetros como velocidad específica de crecimiento, rendimiento de producto por biomasa y productividad, entre otros.Que el alumno aprenda sobre el efecto de los elicitores como estrategia para incrementar la producción de metabolitos secundarios en plantas.Que el alumno se familiarice con las técnicas de remoción in situ de producto como estrategia para recuperar metabolitos secundarios de cultivo in vitro de tejidos.Metodología.Se trabajó con una suspensión de Rubia tinctorum, cultivada de forma estéril en medio Gamborg B5, adicionado con: sacarosa (20 g/L), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2 mg/L), ácido indolacético (0,5 mg/L), ácido naftalenacético (0,5 mg/L) y kinetina (0,2 mg/L); pH final: 5,75-5,80. Las raíces transformadas se cultivan en medio WPM con sacarosa 20 g/l. Los cultivos vegetales serán mantenidos a lo largo de todo el ensayo bajo condiciones controladas de temperatura (24±2 °C), fotoperíodo (8 horas de luz/16 horas de oscuridad), y humedad (40%), en cámaras de cultivo acondicionadas en condiciones de agitación a 100 rpm en agitador orbital. Como agente elicitor se empleó metiljasmonato (MeJa, 100 µM) y se evalúa su efecto a las 48 hs. Para el ensayo de remoción in situ del producto se utiliza Miglyol al 10%. Se determinará AQs en intracelulares, en el medio de cultivo y la fase orgánica. La viabilidad celular se determinará utilizando el test de exclusión del colorante Evans Blue, según lo descripto por Smith et al. (1982). El contenido de antraquinonas se determinará en las muestras vegetales según lo descripto por Zenk (1975).Resultados y Discusión.Se obtuvo una curva de crecimiento para cada sistema de cultivo (suspensiones y raíces).se evaluaron los parámetros cinéticos de los respectivos cultivos en Batch (velocidad específica de crecimiento, rendimiento de producto por biomasa y productividad)Se evaluó el efecto del tratamiento con MeJa como elicitor obteniendo un incremento en el contenido de AQs intra e extracelulares.Se evaluó el efecto del agregado de Miglyol como estrategia de recuperación in situ del producto.Conclusión.En base a los resultados obtenidos los alumnos pudieron determinar los parámetros del cultivo en batch de suspensiones y raíces transformadas. También pudieron calcular las productividades de cada sistema y compararlos.Además, pudieron evaluar el efecto positivo del MeJa sobre la producción de AQs y el efecto de liberación al medio de cultivo que producen sobre todo en raíces.El agregado de Miglyol como segunda fase para la recuperación in situ del producto es exitosa y mejora las productividades de los cultivos de raíces transformadas.La evaluación de los resultados permitió a los alumnos reforzar los conocimientos prácticos con los vistos en la clase teórica sobre bioprocesos con cultivos vegetales y adquirir práctica en el manejo y optimización del cultivo in vitro para la producción de metabolitos secundarios.BibliografíaHan, Y. S., R. Van der Heijden, et al. (2001). "Biosynthesis of anthraquinones in cell cultures of the Rubiaceae " Plant Cell, Tissue and Organ Culture 67(3): 201-220. Perassolo M et al. Role of reactive oxygen species and proline cycle in anthraquinone accumulation in Rubia tinctorum cell suspension cultures subjected to methyl jasmonate elicitation. Plant Physiology and Biochemistry.2011, 49:758-763Samuelsson, G. (1999). Drugs of natural Origin - A Textbook of Pharmacognosy, Swedish Pharmaceutical Society, Swedish Pharmaceutical Press. Smith A et al. Relationship between vital staining and subculture growth during the senescence of plant tissue culture. Plant Physiol. 1982, 70:1228-1230.Zenk MH et al. Anthraquinone production by cell suspension cultures of Morinda citrifolia. Planta Medica. 1975, Suppl:79-101.Vasconsuelo, A. and R. Boland (2007). "Molecular aspects of the early stages of elicitation of secondary metabolites in plants." Plant Science 172: 861-875.