Biocatálisis como estrategia para la producción de compuestos de interés farmacéutico: Alcaloides del tropano

CARDILLO, ALEJANDRA BEATRIZ; CARDILLO, SABRINA BEATRIZ; RODRIGUEZ TALOU, JULIAN; GIULIETTI, ANA MARIA

Encuentro; V Encuentro Regional de Biocatálisis y Biotransformaciones (EnReBB); 2012

Sociedad Argentina de Biocatálisis y Biotransformaciones

Las plantas son capaces de producir una gran diversidad de productos naturales que son de interés con fines medicinales. Hiosciamina y escopolamina son alcaloides del tropano ampliamente utilizados en medicina debido a su actividad anticolinérgica. La escopolamina posee una demanda y valor económico 10 veces superior al de la hiosciamina. Asimismo, se han descripto nuevas aplicaciones para la 6b-hidroxihiosciamina lo que ha reavivado el interés en el uso de éstos alcaloides. La enzima Hiosciamina 6b-hidroxilasa cataliza la conversión de hiosciamina en 6b-hidroxihiosciamina y escopolamina mediante dos reacciones secuenciales (Figura 1). En la actualidad estos alcaloides son extraídos a partir de la explotación de la fuente natural dado que la síntesis química de los mismos presenta numerosas dificultades y es costosa. Por ésta razón, resulta de interés el desarrollo de un proceso de biotransformación para la producción de los mismos con fines farmacéuticos. En el presente trabajo se exploró la posibilidad de producir 6b-hidroxihiosciamina y escopolamina mediante una estrategia alternativa utilizando a la enzima H6H como biocatalizador. Para lograrlo, el gen h6h fue amplificado a partir de preparaciones de ARNt obtenidas desde anteras inmaduras de Brugmansia candida, una planta nativa de Sudamérica y productora de alcaloides del tropano. El h6hADNc fue clonado en diferentes vectores con el objeto de producir enzimas etiquetadas y no etiquetadas. La enzima H6H fue expresada como fusión en su extremo C-terminal al epitope V5 y una cola de histidinas (H6H-V5-6His). Por otro lado, fue fusionada en su extremo N-terminal al dominio de unión a celulosa (CBD-H6H) con el objeto de combinar los pasos de purificación e inmovilización a la matriz de bajo costo celulosa. Las construcciones generadas fueron introducidas en Saccharomyces cerevisiae CEN PK2 mediante el método de transformación química. Para explorar las distintas estrategias propuestas, se ensayó la actividad de la enzima a partir de extractos crudos de las cepas de levaduras inducidas. Los ensayos se llevaron a cabo a 30°C por 15h. El análisis de los alcaloides transformados se realizó por HPLC con detección UV, siendo la fase móvil utilizada Ácido octanosulfónico 0,01M pH3/Metanol (65:35) y la velocidad de flujo 1 ml/min. Los resultados mostraron que la enzima H6H etiquetada y no etiquetada fue capaz de transformar hiosciamina, demostrando la expresión funcional del h6hcDNA en levaduras. Sin embargo, los productos obtenidos fueron diferentes de acuerdo a la enzima utilizada. La H6H y la CBD-H6H fueron capaces de convertir hiosciamina en 6b-hidroxihiosciamina y escopolamina, mientras que la H6H-V5-6His solo produjo 6b-hidroxihiosciamina en los tiempos ensayados. El dominio de unión a celulosa no afectó la actividad catalítica de la enzima a diferencia de lo sucedido con el epitope V5 y la cola de 6His. Estos hechos son alentadores en vías al desarrollo de un proceso biocatalítico para la producción de los alcaloides del tropano de más valor mediante la aplicación de enzimas inmovilizadas.