Obtención de alcaloides del tropano por cultivos de raíces transformadas en biorreactores

CARDILLO, ALEJANDRA BEATRIZ; OTALVARO, ANGELA MARÍA; RODRIGUEZ TALOU, JULIAN; GIULIETTI, ANA MARIA

Simposio; II Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos (SAProBio 2012); 2012

Introducción Los alcaloides del tropano son metabolitos secundarios producidos principalmente por plantas de la familia Solanaceae. Dentro de éste grupo la escopolamina, hiosciamina y su mezcla racémica, la atropina, poseen una gran utilidad farmacéutica debido a su acción anticolinérgica. Asimismo, la escopolamina tiene mayor valor económico y demanda mundial respecto a la hiosciamina y atropina (un orden de magnitud inferior). Recientemente se han descripto potenciales aplicaciones terapéuticas para la anisodamina (6b-hidroxihiosciamina) lo que ha renovado el interés en el uso de los alcaloides del tropano en medicina. En la actualidad estos alcaloides son extraídos a partir de la explotación de las fuentes naturales dado que la síntesis química de los mismos presenta numerosas dificultades y es costosa. El renovado interés en la utilización de cultivos vegetales in vitro para una aplicación a gran escala en la producción de sustancias bioactivas hacen del escalado de los cultivos de raíces transformadas una estrategia interesante para la producción de alcaloides del tropano con fines farmacéuticos. En el presente trabajo las raíces transformadas de B. candida fueron cultivadas en un reactor de tanque agitado de 1,5 L modificado con el objetivo de explorar un sistema de producción alternativo de hiosciamina, anisodamina y escopolamina. Metodología Establecimiento y cultivo de raíces transformadas de B.candida: Las raíces transformadas fueren obtenidas mediante la inoculación de hojas de 30 días de edad con Agrobacterium rhizogenes LBA 9402. Las raíces establecidas fueron mantenidas en medio Gamborg B5/2 libre de hormonas suplementado con sacarosa 20 g/l y ampicilina 1 g/l a 24ºC ± 2ºC y subcultivadas cada 20 días. Cultivo de raíces transformadas en Erlenmeyer y Biorreactor: Para los procesos en Erlenmeyer se inocularon frascos de 125 ml conteniendo 25 ml de Gamborg B5/2 con 0,1 g peso fresco (PF) de raíces transformadas de 20 días de edad. Los cultivos en biorreactor de tanque agitado se realizaron en un BIOFLO III de 1,5L (New Brunswick) con un inóculo de 10g PF. Para el cultivo de las raíces se colocó una malla plástica en zigzag para incrementar la superficie de soporte de las mismas. El cultivo fue aireado a 0,5 vvm. Extracción de alcaloides y análisis por HPLC: Las raíces fueron molidas en N2 líquido e incubadas por 2 h a 100 rpm en presencia de 5 ml de H2SO4 0,2 M. Las muestras obtenidas fueron filtradas y la fase acuosa fue llevada a pH 12 con NaOH 1N para la extracción de los alcaloides con 5 ml de cloroformo. La fase orgánica fue evaporada y el residuo disuelto en metanol:agua (50:50, v/v). El análisis por HPLC se realizó con una columna Li-ChroCART 125-4 60RP-select B (5µm), Merck. La composición de la fase móvil utilizada fue: acido octanesulfónico 0,01M pH3/Metanol (65:35 v/v) y se trabajó isocraticamente a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Resultados El rendimiento de biomasa así como el de los alcaloides producidos por las raíces transformadas de B. candida cultivadas en bioreactor fue superior al obtenido en los cultivos realizados en Erlenmeyer (Tabla 1). Respecto al cultivo en Erlenmeyer, el perfil de los alcaloides producidos varió dependiendo de la edad del cultivo. A los días 5 y 10 el perfil determinado fue H>A>E mientras que a los 20 días de cultivo se vio modificado a A>H>E indicando una modificación en las enzimas clave de la ruta de biosíntesis de alcaloides del tropano y/o su funcionalidad. Asimismo, se observó un incremento constante de las productividades volumétricas. Respecto al cultivo en reactor, la biomasa alcanzada fue de 49,33 g PF. El índice de crecimiento en estas condiciones fue un 36% superior al alcanzado mediante el cultivo en Erlenmeyer (Tabla 1). La anisodamina fue el alcaloide producido predominantemente, siendo su productividad volumétrica 3 veces superior a la calculada en los procesos en Erlenmeyer (Tabla 1). Se observó que las mismas, obtenidas para los cultivos en bioreactor, fueron significativamente superiores (2,8 – 4 veces) que para los procesos en Erlenmeyer. Estas diferencias pueden atribuirse a la influencia del diseño del biorreactor lo cual permitió generar un ambiente óptimo para el crecimiento de las raíces y la producción de alcaloides. Por otra parte, el análisis de la factibilidad tecno-económica del proceso ha arrojado resultados prometedores que están siendo analizados en profundidad. Tabla 1: Influencia del sistema de cultivo de raíces transformadas de B. candida en el rendimiento de alcaloides y productividad. Erlenmeyer Bioreactor IC 2.90 3.93 H 6.00 ± 2.00 7.01 ± 1.35 Alcaloides A 7.80 ± 4.00 10.05 ± 0.76 (mg/g PS) E 0.50 ± 0.30 1.05 ± 0.27 H 1.45 3.90 Yp/s A 1.89 5.60 (mg/g) E 0.12 0.58 T.A 3.47 10.08 H 0.52 ± 0.17 1.44 ± 0.28 Productividad A 0.67 ± 0.34 2.07 ± 0.16 volumétrica (mg/L d) E 0.04 ± 0.02 0.22 ± 0.05 T.A 1.23 ± 0.54 3.72 ± 0.47 H: Hiosciamina, A: Anisodamina, E: Escopolamina, T.A: Alcaloides totales, Yp/x: rendimiento de alcaloides referido a biomasa formada, Yp/s: rendimiento de alcaloides referido a sustrato consumido Conclusiones Una modificación simple introducida en un biorreactor de tanque agitado permitió cultivar raíces transformadas de B. candida para la producción de alcalides del tropano. Los resultados obtenidos en el presente trabajo son potencialmente aplicables en el escalado racional del proceso.