Evolución y Plasticidad Estructural de Metalo-β-lactamasas

PABLO E. TOMATIS; MARÍA ROCÍO MEINI; ALEJANDRO J. VILA

La Plata

Congreso; XXXVII Reunión Anual Sociedad Argentina de Biofísica; 2008

La supervivencia y aptitud de los organismos está condicionada en gran medida por el complejo proceso de evolución de proteínas. La identificación de las características estructurales que se adquieren durante la evolución proteica permitiría la predicción de futuros eventos evolutivos. Las técnicas de Evolución Molecular Dirigida (EMD), que tratan de simular el proceso evolutivo natural, son de gran utilidad para explorar estos aspectos1. La resistencia a antibióticos mediada por enzimas β-lactamasas constituye un ejemplo único en el cual la supervivencia del organismo depende de la actividad hidrolítica de una proteína, brindando un sistema modelo para explorar los mecanismos involucrados en la evolución de proteínas2. Empleando metodologías de EMD, se exploró el potencial evolutivo de la enzima metalo-β-lactamasa BcII de Bacillus cereus. En una primera estrategia, se seleccionaron varios clones mutantes de BcII que confieren niveles de resistencia elevados frente al antibiótico cefalexina3 (2). El estudio sistemático del perfil hidrolítico (3), capacidad de unión de substrato y de las características de sitio activo de la mutante optimizada m5 (4-5), revelaron que la evolución dirigida ha adaptado el sitio activo por medio de mutaciones fuera del mismo. El análisis en detalle de las mutaciones presentes en la mutante m5, mostró que la evolución hacia una enzima MBL optimizada, ha ocurrido a través de un efecto sinérgico. Por un lado, gracias a la optimización del paso limitante de la velocidad de reacción (6) mediada por el ajuste de la posición relativa del ion metálico de sitio Zn2 (5), y por el otro debida al aumento de la flexibilidad de los loops que flanquean el sitio activo (5 7). Los datos de concentración inhibitoria mínima (MICs) y de actividad de las distintas mutantes muestran un fenómeno de sinergia entre las mutaciones (8). La enzima BcII WT es muy estable, y la desestabilización producida por la mutación responsable del aumento de actividad, no es compensada por las otras mutaciones (9). Otra estrategia empleada para evaluar la evolución proteica, consiste en emplear mutantes inactivas de la enzima BcII en las cuales se le depletaron los ligandos del sitio activo4. Para evaluar el potencial de estas enzimas de recuperar actividad lactamasa, ya sea mediante la restitución de los residuos aminoacídicos originales o la adquisición de nuevos residuos en esas posiciones o en otras, se las está sometiendo a estrategias de EMD (10).