CONICET | Buscador de Institutos y Recursos Humanos

El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causa la enfermedad viral más importante del maíz en Argentina, provocando síntomas severos que disminuyen el rendimiento de este cultivo. Como el resto de los virus de la familia, MRCV replica y ensambla su material genético en estructuras citoplasmáticas dinámicas llamadas viroplasmas, formados por las proteínas no estructurales P9-1 y P6, ARN viral y proteínas del hospedante. P6 es una proteína básica de 90 kDa, tiene un dominio coiled-coil central, y una región desordenada N-terminal que dificulta su expresión de manera soluble. Por otro lado, los nanoanticuerpos (Nbs) son proteínas pequeñas (12 ? 15 kDa) capaces deunir un antígeno con alta afinidad que derivan de los dominios variables de los anticuerpos de cadena pesada, un tipo especial de anticuerpos presentes en camélidos. Con el objetivo de obtenerNbs específicos contra P6, se inmunizó una llama con dos versiones recombinantes de P6. Luego de tres rondas de biopaneo mediante display de fagos de una biblioteca generada a partir de ARN extraído de los linfocitos de la llama inmunizada, se evaluaron 95 clones mediante un ELISA de fagos y se obtuvieron 16 clones con señal positiva, cuya secuencia mostró 15 clones de secuencia única, que fueron clasificados en 12 familias según sus regiones CDR3. Para seleccionar a los Nbs con mayor afinidad por P6, se expresó un Nb de cada familia en E. coli y se realizó un ELISA de extracto periplásmico. Tres Nbs consistentemente presentaron valores de absorbancia por encima de la línea de corte, y fueron seleccionados para continuar su caracterización por doble híbrido de levaduras, evaluando su interacción con P6 y con distintas versiones mutantes. En conclusión, la inmunización de una llama con versiones mutantes de P6 resultó en la obtención de Nbs capaces de reconocer a la proteína completa y determinamos que el epítope reconocido por los tres Nbs se encuentra en la región C-terminal de P6.