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Introducción. La tuberculosis bovina (TB) se diagnostica in vivo mediante la inoculación intradérmica de una mezcla antigénica compleja denominada derivado proteico purificado (del inglés protein purified derivative, PPD). Se han caracterizado nuevas moléculas1, para complementar el rendimiento del PPD, o para el desarrollo de un diagnóstico diferencial en el marco de un potencial uso de candidatos vacunales como BCG2. En nuestro país, se desarrolló un candidato vacunal experimental contra la tuberculosis bovina (TB)3 delecionado en el gen phoP, que codifica un miembro de un sistema regulador de dos componentes relacionado con la virulencia. Su estudio en el marco del desarrollo de un potencial diagnóstico diferencial entre animales vacunados e infectados resulta de interés. Se describió que PhoP induce respuesta humoral en humanos con tuberculosis4, pero no se caracterizó su potencial antigénico en bovinos. El objetivo del trabajo fue estudiar la respuesta inmune inducida por PhoP en la infección natural por M. bovis, con el fin de aportar datos novedosos acerca del potencial antigénico de esta proteína. Materiales y métodos. Se realizó abordaje in sílicocon el fin de ponderar la especificidad e inmunogenididad asociada a PhoP. Se comparó el porcentaje (%) de similitud de PhoP de Mycobacterium bovis con micobacterias que presenten ≥90% de cobertura en los 247 aa, Corynebacterium sp y Nocardia farcinica (Protein BLAST). Se predijo la presencia de epitopes en el contexto del Antígeno Leucocitario Bovino de clase II (BoLA-II) (NetBoLAIIpan) seleccionando péptidos(15mer) con alta afinidad de unión (Rank%entre 0-2). PhoP recombinante (PhoPr) se expresó a partir del vector pET-15b-phoP (cedido por el Dr. Gonzalo Asensio), en E. coli BL21pLYs en LB, ampicillina (100µg/mL), IPTG (0.1mM). Se purificó por cromatografía de afinidad (ProteinIso Ni-NTA Resin, Biotech)y visualizó por WB (Mouse Mab Anti-polyHistidine, SigmaAldrich). Su identidad se confirmó por espectrometría de masas (Orbitrap, ThermoScientific, Q-Exactive). Se obtuvo 10mL de sangre heparinizada de vacas Holando-Argentino: 10 provenientes de zona/establecimiento libre de TB, 6 animales negativos a la intradermorreacción (IDR) (anérgicos) con presencia de lesiones compatibles con TB (LCTB)) y 7 animales positivos a la IDR con LCTB. La sangre se estimuló con PhoPr (10µg/mL), una proteína de fusión 3615c/ESAT6/CFP10 (CV) (10µg/mL) (cedida por elDr. Vordermeier), PPDaviaryPPDbovina, PBS1X y un mitógeno (Pokeweed, PKW). Se utilizó Bovigam TB Kit (Thermo Fisher) para medir el IFN-ɣen el sobrenadante. Se empleó un cut-off de 0,1. Se registró la magnitud de la respuesta (DO450nm) y frecuencia de animales respondedores (FR, número de animales con una DO450≥0,1 para un determinado antígeno sobre el total de animales del grupo x 100). El análisis estadístico se realizó mediante el test de Kruskal Wallis y el post test de Dunn (GraphPad)Resultados. El análisis in sílico confirmó la presencia de PhoP en el genoma de M. tuberculosis y de 20 especies de micobacterias ambientales, Nocardia farcinica y Corynebacterium sp., con un % similitud de la secuencia ≥ 75% respecto de la proteína PhoP de M. bovisen el 70% (16/23) de las secuencias de aminoácidosanalizadas. Se identificaron 15 péptidos con restricción por el BoLA-II. Se obtuvo la proteína PhoPr con una concentración de 2.8µg/mL y con un grado de pureza que permitió su empleo en la estimulación de sangre. Respecto del IFN-gamma en el grupo IDR+/LCTB, se observó una FR de 57,1% (4/7) para PhoPr y 85,7% (6/7) para la proteína de fusión CV, significativamente menores respecto del PPDbovina (p=0,0083), cuya FR fue del 100%. La magnitud de la respuesta fue significativamente menor para los antígenos recombinantes respecto del PPDbovina (p=0, 0083). En el grupo de bovinos anérgicos IDR-/LCTB, se observaron valores de FRmenores: 33% (2/6) para el antígeno PhoPr, y 50% (3/6) para la proteína de fusión (CV). No se detectaron diferencias significativas en la magnitud de la respuesta entre los antígenos recombinantes y el PPD bovina (p=0,1989). En animales del grupo IDR+/LCTB y anérgicos se observó una superposición de la respuesta respecto de los antígenos rPhoP y la proteína de fusión CV, con la excepción de un animal que solo reaccionó ante la estimulación con PhoPr. En los animales negativos no se detectó reactividad para los antígenos ensayados, con la excepción del mitógeno PKW. Discusión y conclusión. Se demostró que la proteína PhoPr de M. bovis es inmunogénica y específica sugiriendo su posible empleo como antígeno en la prueba de IFN-gamma. Si bien la FR de PhoPr fue menor a la obtenida con los antígenos CV y PPDbovina, PhoPr indujo respuesta en animales anérgicos, incluso en un caso en el cual ni el PPDbovina ni la proteína de fusión CV reaccionaron. Aunque preliminares, estos resultados sustentan la continuidad del estudio con el fin de caracterizar su potencial aplicación diagnóstica.