Tuberculosis en cabras: comparación de tres secuencias blanco de PCR para la detección de Mycobacterium bovis en leche

MAGNANO, GABRIEL; SCHNEIDER M,; ZUMÁRRAGA MJ.; MACIAS A,; MACIO M.,; BIGI, FABIANA; ROCHA RV,; STICOTI E.E.,; GARRO CJ,

San Carlos de Bariloche

Congreso; XXIII Reunión Científico Técnica y 1° Virtual Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico; 2021

AAVLD

Introducción. Mycobacterium bovis (M. bovis) es el agente causal de la tuberculosis bovina (TBB), enfermedad zoonótica que afecta a distintos hospedadores. La infección por M. bovis en el ganado caprino es menos frecuente que en el bovino, siendo su prevalencia variable según el año y la región en estudio (0,67-7,3%). En el año 2015, se demostró la existencia de lesiones compatibles con tuberculosis (LCT) en 51 cabras provenientes de 8 hatos de pequeños productores que habían resultado positivas a la prueba tuberculínica (Magnano et al., 2015). Las técnicas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), permiten identificar la presencia de micobacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis (CMT) como M. bovis y Mycobacterium caprae en distintos tipos de muestra incluyendo la leche. El objetivo de este trabajo fue detectar especies del CMT, a partir de muestras de leche de cabra, mediante PCR de punto final comparando diferentes secuencias blanco. Materiales y métodos. Se estudiaron muestras de leche de 24 cabras reaccionantes a la prueba tuberculínica. Esas cabras habían sido faenadas, cultivados sus órganos y leche. Los 17 aislamientos obtenidos de tejidos fueron tipificados por spoligotyping (Magnano, 2015). Además, se procesaron 32 muestras de leche de animales libres de TBB. Un volumen de 500µL de leche fue procesado mediante digestión enzimática con proteinasa K y posterior extracción con solventes orgánicos (fenol / cloroformo / alcohol isoamílico) precipitando el ADN total con isopropanol en medio salino (Zumarraga et al., 2012). El ADN extraído se cuantificó por espectrofotometría (Nanodrop) y se evaluó su calidad según la relación A260/A280. Se emplearon 2 µL de ADN como templado en la reacción de PCR, con el fin de amplificar un fragmento de 448 pb de la secuencia Rv2807, 245 pb de la secuencia IS6110 presente en los miembros del CMT y la secuencia TbD1 de 51 pb presente en M. bovis, M. africanum y en cepas ancestrales de M. tuberculosis (Araújo et al., 2014). Los productos de amplificación se separaron por electroforesis en geles de agarosa, al 2% para IS6110 y Rv2807 y al 3% para TbD1, se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron por exposición a un transiluminador de luz UV, estimando el tamaño del fragmento amplificado por comparación con marcadores de peso molecular (100bp y 50bp DNA Ladder, Promega). Se calculó el Valor Predictivo Positivo (VPP) y Negativo (VPN) y concordancia (índice kappa, ĸ) de la prueba considerando al cultivo de tejidos como el estándar de oro del diagnóstico de la enfermedad. Resultados. De un total de 24 muestras analizadas, 11 (45,8%), resultaron positivas tanto por PCR-IS6110 como PCRRv2807, mientras que las 13 (54,2%) restantes resultaron negativas. Por PCR-TbD1 19 muestras (79,17%) resultaron positivas, mientras que los 5 restantes (20,83 %) fueron negativas. Los cultivos de las leches resultaron negativos en todos los casos, sin embargo, en 14 de las 19 muestras que tuvieron PCR positiva, se confirmó la presencia de M. bovis porcultivo de los órganos y por spoligotyping. En todos los casos se obtuvo el espoligotipo SB0140, el más frecuente de las muestras analizadas de Argentina. Todas las muestras de leche de animales libres de tuberculosis tuvieron PCR negativas con las tres secuencias blanco. Discusión y conclusión. En este trabajo se confirmó que la leche caprina constituye una buena matriz para la extracción de ADN de calidad para ser utilizado como templado de la PCR. La PCR-TbD1 fue la más sensible para la detección de M. bovis en leche, habiéndose confirmado por cultivo de tejidos el 73,6% de las muestras con PCR-TbD1 positiva (14/19). Un estudio previo realizado por Zumárraga y col. (2012) en bovinos lecheros permitió identificar rodeos infectados en tambos con certificación de libre de TBB, mediante el análisis de la leche del tanque. Considerando este antecedente, podemos concluir que el método utilizado para la detección de M. bovis en leche caprina es una estrategia valiosa y podría utilizarse complementariamente a las técnicas oficiales de diagnóstico. La PCR-TbD1 constituiría una nueva herramienta para la detección de M. bovis en esa matriz, alimento que por sus características nutricionales cobra cada vez más importancia en el país y en el mundo.