Diseño de ligandos por medio del doble screening de bibliotecas peptídicas e identificación de los péptidos por MALDI-TOF MS/MS

MARTÍNEZ CERON MARÍA C.; GIUDICESSI SILVANA L.; KRUSZYN JOHANNA N.; MARANI MARIELA M.; ALBERICIO FERNANDO; CASCONE OSVALDO; CAMPERI SILVIA A.

Los Cocos, Córdoba

Congreso; I Congreso Argentino de Espectrometría de Masa; 2012

Sociedad Argentina de Espectrometría de Masa

El screening de bibliotecas combinatorias peptídicas permite hallar ligandos con actividad farmacéutica, usos analíticos o de afinidad para la purificación de proteínas. El método Dividir-Acoplar-Recombinar (DAR), permite la síntesis de bibliotecas combinatorias en fase sólida en las cuales cada bolilla de resina presenta una única entidad peptídica. Consiste en (i) dividir el soporte sólido en porciones iguales, (ii) acoplar a cada porción individual un aminoácido diferente y (iii) mezclar las porciones. Para el screening de la biblioteca se pone a interaccionar la misma con una pequeña cantidad de la proteína blanco. Para identificar aquellas bolillas que adsorben la proteína, y que por lo tanto contienen los péptidos con afinidad por la misma, se puede utilizar anticuerpos primarios y secundarios apropiados o marcar la proteína con una enzima, un colorante fluorescente u otro tipo de etiqueta. Las bolillas que hayan interactuado con la proteína marcada, son aisladas para determinar la secuencia del péptido. Para evitar la selección de falsos positivos por la interacción de la etiqueta o reactivos con el péptido, en el presente trabajo se desarrolló una estrategia de doble screening utilizando como proteína modelo la seroalbúmina bovina (SAB). Se etiquetó la SAB con el colorante fluorescente Texas red (SAB-Tr) y con biotina (SAB-B). Se construyeron por el método DAR dos bibliotecas combinatorias peptídicas: (Ac)HX1X2X3X4X5GAG-NH2, X=A, E, F, G, H, L, N, P, R, S, T (Biblioteca A) y X1X2EX3X4RGAG-NH2, X=A, D, E. F, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, Y (Biblioteca B). Las bibliotecas fueron sintetizadas sobre bolillas de 4-hidroximetilbenzoil (HMBA)-ChemMatrix por el método DAR. Para el primer screening, se pusieron las bolillas de las bibliotecas en contacto con una solución de bloqueo (Leche en buffer de fosfatos salino con Tween (PBS-Tw ) y, tras ser lavadas, se las incubó con SAB-Tr en PBS-Tw. Se seleccionaron las bolillas que presentaban fluorescencia roja con el Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS), equipo que aísla las bolillas fluorescentes. Antes de someter las bolillas al segundo método de screening, se las colocó en jeringas con filtro y se las lavó con ácido acético (AcOH):acetonitrilo (MeCN):H2O para desorber la proteína marcada. Luego de su acondicionamiento, se colocaron las bolillas en solución de bloqueo y se las incubó con SAB-B en PBS-Tw. A continuación, se las incubó con estreptavidina-peroxidasa en PBS-Tw y se revelaron con 3-3´ diaminobencidina y H2O2. Se aislaron aquellas bolillas que presentaron coloración marrón. Se lavaron las bolillas con agua y se las incubó con AcH/MeCN/H2O. Se eliminó la solución de lavado por succión y se adicionó metanol/H2O con trifluoracético. Se lavaron secuencialmente con MeCN y diclorometano. Para clivar los péptidos de las bolillas para su secuenciación por MALDI-TOF MS/MS, cada peptidilbolilla aislada fue colocada en un microtubo eppendorf, los cuales se dispusieron dentro de un desecador junto a un frasco conteniendo NH4OH. Se cerró el desecador y se dejó toda la noche a temperatura ambiente. Esto permitió el clivaje del péptido unido al ancla HMBA por una unión éster. Luego, se eluyeron los péptidos de cada bolilla con  AcH/MeCN/H2O. Los espectros de masas se realizaron en un equipo 4700 Proteomics Analyzer Instrument (Applied Biosystems, Foster City, CA, EEUU). Se sembró la muestra por el método de depósito de capas secas sucesivas (Successive Dry Layers Deposit, SDLD). Para ello se sembró 1µl del eluato proveniente de una sola bolilla sobre la placa de muestra del MALDI-TOF MS, se dejó secar a temperatura ambiente y luego se añadió 1 µl de matriz CHCA (4 mg/ml) en una solución de MeCN/H2O (1:1) con TFA 0,1% y se dejó secar nuevamente. Los espectros de masas se realizaron en modo reflectron ion positivo y los espectros MS/MS se obtuvieron en modo positivo. En total se obtuvieron 15 secuencias de la biblioteca A y 45 de la biblioteca B. En las secuencias obtenidas a partir de la biblioteca A, el aminoácido con mayor frecuencia de aparición en las posiciones X1-X4, fue la His. En la posición X2 también se vió la Phe aunque con menor frecuencia. En la posición X4 se vieron en una frecuencia ligeramente menor los aminoácidos Pro y Thr. En cambio en la posición X5 el aminoácido con mayor frecuencia fue el Asp y en menor frecuencia los aminoácidos Phe e His. Para la biblioteca B, el aminoácido que presentó mayor frecuencia en la posición X1 fue la Arg y en la posición X2 la His. En las posiciones X3 y X4 ningún aminoácido presentó una frecuencia aumentada. Se resintetizaron los péptidos que presentaron mayor frecuencia de aparición y que además mostraron consenso con el resto de los péptidos aislados. Se evalúo la afinidad de los mismos por la SAB. Todos los péptidos presentaron afinidad por la SAB demostrando que el método desarrollado evita la selección de falsos positivos en el screening debidos a la interacción entre los ligandos peptídicos con las etiquetas o los reactivos utilizados.