Aislamiento y purificación del inhibidor de la primera proteína del sistema del complemento

MARANI MARIELA M.; TUBÍO ROSARIO

Ciudad Autonoma de Buenos Aires, ARGENTINA

Congreso; III Congreso Nacional de estudiantes de Farmacia; 2002

Facultad de Farmacia y Bioquímica

La heparina es un proteoglicano localizado principalmente en los mastocitos y que posee actividades biológicas muy importantes. La más conocida es su actividad anticoagulante ejercida aumentando más de 1000 veces la velocidad de inhibición de la trombina por la antitrombina (AT).También es importante su inhibición del sistema del complemento, tanto sobre la vía clásica como sobre la vía alternativa. Nuestro grupo de trabajo ha estudiado exhaustivamente las propiedades de la interacción de la heparina, ya sea la nativa (UNFH) o la de bajo peso molecular (LMWH),con el primer complejo proteico de la cascada del complemento humano (C1). La unión de la heparina con el C1, en condiciones muy controladas de baja fuerza iónica y presencia de iones calcio, permite seleccionar en el precipitado de la interacción una subpoblación del glicosamlnoglicano con una actividad anticoagulante superior a la de la preparación inicial. Existe normalmente en el plasma una proteína que controla la activación del complejo C1, que actúa como inhibidor del mismo (C1-INH), y al cual se une provocando la disociaciónde las subunidades que lo integran (C1q,C1ryC1.). El objetivo del presente trabajo es el aislamiento de muestras puras de C1-INH humano para el posterior estudio de la interacciónde esta proteína regulatoria con la heparina. En primer lugar se realizó una búsqueda bibliográfica sobre las diferentes técnicas de aislamiento y purificación del (C1-INH), a partir de las cuales, se diseñó un protocolo experimental que resultó de la combinación de dos técnicas de aislamiento: la de Harrison y la de Prograls. Los principales pasos de la técnica modificada inctuyen una primera etapa de recuperación y una segunda etapa de purificación. En la primera etapa el plasma humano, previamente tratado con agentes quelantes e inhibidoresde enzimas proteoliticas se precipita selectivamente con diferentes concentraciones de polietilenglicol (PEG). La purificación se lleva a cabo a través de dos procedimientos cromatogáficos sucesivos: cromatograflade intercambio aniónico y de exclusión molecular. El perfil de bandas obtenido en cada una de las diferentes etapas del aislamiento se siguió a través de electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida(SDS-PAGE). Por medio de esta técnica se obtuvo una fracción proteica que permitió iniciar el estudio de las caracterlstlcas de la interacción entre el C1-INHy la heparina y del complejo temario que incluye también al C1.En primer lugar se realizó una búsqueda bibliográfica sobre las diferentes técnicas de aislamiento y purificación del (C1-INH), a partir de las cuales, se diseñó un protocolo experimental que resultó de la combinación de dos técnicas de aislamiento: la de Harrison y la de Prograls. Los principales pasos de la técnica modificada inctuyen una primera etapa de recuperación y una segunda etapa de purificación. En la primera etapa el plasma humano, previamente tratado con agentes quelantes e inhibidoresde enzimas proteoliticas se precipita selectivamente con diferentes concentraciones de polietilenglicol (PEG). La purificación se lleva a cabo a través de dos procedimientos cromatogáficos sucesivos: cromatograflade intercambio aniónico y de exclusión molecular. El perfil de bandas obtenido en cada una de las diferentes etapas del aislamiento se siguió a través de electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida(SDS-PAGE). Por medio de esta técnica se obtuvo una fracción proteica que permitió iniciar el estudio de las caracterlstlcas de la interacción entre el C1-INHy la heparina y del complejo temario que incluye también al C1.