Desarrollo de ligandos peptídicos para la purificación de biofármacos proteicos

CAMPERI SILVIA A.; MARANI MARIELA M.; ROMERO, LUCIA V.; IANNUCCI NANCY B.; CÔTÉ SIMON; ALBERICIO FERNANDO; CASCONE OSVALDO

Ciudad Autónoma de Buenos Aires, ARGENTINA

Congreso; JorFyBI VIII Jornadas de Farmacia y Bioquímica Industrial; 2005

Asociación Argentina de Farmacia y Bioquímica Industrial

Introducción: Las proteínas recombinates de interés farmaceútico tienen un uso restringido debido a su elevado costo. Alrededor del 80% del costo total de producción es debido a los procesos de purificación. En este escenario, la cromatografía de afinidad con ligandos peptídicos inmovilizados se presenta como una alternativa adecuada a nivel industrial debido a su bajo costo y alta afinidad en comparación a los anticuerpos monoclonales. El desarrollo de bibliotecas peptídicas provee una técnica que permite ensayar decenas de millones de péptidos en forma empírica, lo que facilita el descubrimiento de ligandos adecuados para cualquier proteína de interés. El método dividir-acoplar-recombinar (DAR), permite obtener todas las combinaciones posibles de los aminoácidos en la forma de una bolilla-un péptido. Los ligandos peptídicos pueden seleccionarse por screening inmunoquímico y luego ser analizados por secuenciación de Edman, que al ser altamente costosa y lenta retarda la obtención de ligandos peptídicos. El objetivo de este trabajo fue el desarrollo de una estrategia de preparación de bibliotecas una bolilla-un péptido que permita su análisis por inmunoafinidad y secuenciación por espectrometría de masa (MS/MS) de manera de acortartar los tiempos y disminuir los costos con respecto a las metodologías tradicionales. Materiales y Métodos: Se utilizó como soporte sólido la resina a base de PEG Aminomethyl-ChemMatrixR  a la que se le unió el ancla ácido 4-hidroximetilbenzoico (HMBA). El ester bencílico que forma el HMBA con el primer aminoácido es estable en piperidina y TFA por lo que es aplicable tanto a la química Fmoc como Boc.  Se construyó una bliblioteca combinatoria sobre la HMBA-ChemMatrixR de octapéptidos XXXXGGGG donde X=A, P, R por el método DAR usando la química Fmoc. Se clivaron los grupos protectores con TFA. Posteriormete se realizó el screening inmunoquímco de la bibliteca para el anticuerpo monoclonal anti factor de crecimiento de colonia de macrófagos y granulocitos (mAb anti GM-CSF). Las bolillas que mostraron una reacción positiva fueron aisladas. Los péptidos se clivaron con vapor de amoníaco y se secuenciaron por electrospray-ionisation MS/MS. Resultados: La resistencia del HMBA al clivaje por TFA permitió el clivaje del los grupos protectores de las cadenas laterales de los péptidos sin separación del péptido de la resina, lo que es esencial porque el péptido debe quedar unido a la resina para su screening inmunoquímico. La resina a base de PEG ChemMatrixR  es anfifílica, facilitando el screening inmunoquímico. La resistencia de la ChemMatrixR  a condiciones nucleofílicas permitió el clivaje del péptido con vapor de amoníaco para su posterior análisis por espectrometría de masa. El clivaje con amoníaco es conveniente por su bajo costo y porque no deja residuos. La secuencia obtenida por electrospray-ionisation MS/MS fue APARGGGG. La misma coincide con la obtenida anteriormete por secuenciación de Edman. Conclusiones: La metodología desarrollada permite acelerar el desarrollo de ligandos peptídicos para su uso en cromatografía de afinidad aplicada a de biofármacos proteicos.