Fenotipo diferencial de la deficiencia de enzimas lipoiladas en bacterias Gram-positivas

MC MANSILLA; N MARTÍN; DM RUIZ; D DE MENDOZA

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; XIII Congreso Argentino de Microbiología - CAM 2013; 2013

Sociedad Argentina de Microbiología (AAM)

El ácido lipoicoes un cofactor organosulfurado que se encuentra ampliamente distribuido en lamayoría de los organismos procariotas y eucariotas. Es esencial para elfuncionamiento de varias enzimas clave implicadas en el metabolismo oxidativo,incluyendo a los complejos piruvato deshidrogenasa (DH), α-cetoglutaratoDH, DH de cetoácidos ramificados y acetoína DH, y el sistema de ruptura de laglicina. En los complejos DH el ácido lipoico se une específicamente a dominiosproteicos presentes en la subunidad E2, lo mismo ocurre en el sistema deruptura de la glicina, en el cual la proteína GcvH es la que se encuentramodificada por unión al cofactor. Las proteínas implicadas en la síntesis yutilización de ácido lipoico y las que dependen de este cofactor para suactividad han sido vinculadas con la patogénesis de distintos microorganismos.La vía de síntesis de ácido lipoico en bacterias Gram-positivas es más complejaque en Gram-negativas. En la bacteria modelo B. subtilis el octanoatoproveniente del metabolismo lipídico es transferido desde ACP a la proteínaGcvH mediante la acción de LipM, unaoctanoil-ACP:proteína-N-octanoiltransferasa. Posteriormente la GcvH:E2amidotransferasa LipL, cataliza la transferencia de la porción octanoilo desdeGcvH a las subunidades E2 de los complejos DH. Los dominios octanoilados sonsustrato de LipA, que introduce dos átomos de azufre en la cadenahidrocarbonada del octanoilo unido a enzima. En la vía de utilización dellipoato proveniente del medio, éste es transferido a los dominios lipoilablesen una reacción de dos pasos dependiente de ATP, catalizada por LplJ. Lasmutantes delta lipA, delta lipM, delta lipL y delta gcvH de B. subtilispresentan una deficiencia en la lipoilación de los complejos DH que ocasionadefectos en el crecimiento en medio mínimo. En este trabajo mostramos queademás está afectada la capacidad de esporular. Para intentar definir quédeficiencia enzimática es la responsable del fenotipo de esporulación,construimos cepas en las cuales sólo algunas de las enzimas dependientes deácido lipoico eran funcionales. Mediante reemplazo génico usando un casete deresistencia a espectinomicina construimos una mutante nula en la subunidad E2de la DH de cetoácidos ramificados. La pérdida de dicha subunidad se comprobómediante Western blot con anticuerpos anti-lipoato. Esta cepa fue capaz decrecer en medio mínimo sólo cuando fue suplementado con los precursores de losácidos grasos ramificados, pero esporuló de manera similar a la cepa salvaje.Mediante ensayos de crecimiento en medio mínimo y Western blot comprobamos queuna cepa delta gcvH que expresa en trans la proteína homóloga de S. aureuspuede lipoilar la piruvato DH, pero no las otras DH. Esta cepa no mostrófenotipo de esporulación. Estos resultados sugieren que el defecto en laesporulación observado en las mutantes en la síntesis de lipoato se debería ala falta de