Evaluación del cofactor limitante para la biotransformación de hiosciamina con células microbianas recombinante

CARDILLO, ALEJANDRA BEATRIZ; MINOIA, JUAN; PERASSOLO, MARÍA; RODRÍGUEZ TALOU, JULIÁN; GIULIETTI, ANA MARÍA

Montevideo

Simposio; II Simposio Latinoamericano de Biocatálisis y Biotransformaciones (SiLaBB II - EnReBB VII); 2016

Los alcaloides del tropano son sustancias bioactivas de amplia utilización en medicina. Actualmente son obtenidos mediante su extracción a partir de especies vegetales productoras debido a la dificultad y costos de la síntesis química. Además, las especies utilizadas son crecidas por al menos dos años en invernaderos y producen principalmente hiosciamina, siendo la 6β-hidroxihiosciamina y escopolamina los alcaloides de mayor demanda comercial y valor económico. La enzima Hiosciamina 6β-hidroxilasa (H6H) cataliza la conversión de hiosciamina (alcaloide presente en mayor proporción en la naturaleza) en 6β-hidroxihiosciamina y escopolamina mediante dos reacciones secuenciales (Fig. 1). En nuestro laboratorio fueron construidas cepas de Escherichia coli que portan el gen de la enzima H6H aislado de Brugmansiacandida, planta nativa de Sudamérica y productora de alcaloides del tropano. Células enteras de las cepas recombinantes fueron capaces de biotransformar hiosciamina adicionada al medio de reacción. Sin embargo, el sistema resultó más eficiente al suplementarlo con los cofactores requeridos en los ensayos in vitro de la enzima aislada (Ascorbato, 2-oxoglutarato, Fe2+, catalasa). El objetivo del presente trabajo fue evaluar el cofactor limitante de la reacción para una eficiente biotransformación de hiosciamina en los alcaloides de valor agregado utilizando células enteras como biocatalizador. Para la preparación del biocatalizador, las células enteras de las cepas de E.coli Origami recombiantes (O-H6H) fueron inducidas por 4h para la expresión de la enzima, separadas del medio de crecimiento y lavadas con solución fisiológica.Primeramente, se ensayó la capacidad de las células enteras de catalizar la reacción en ausencia de catalasa debido a las características de la cepa huésped de la enzima vegetal. Estos ensayos demostraron que la catalasa no es requerida cuando se utilizan células enteras como biocatalizador de la reacción. Posteriormente, se ensayó la influencia de los demás cofactores. Se observó que solo el 2-oxoglutarato es necesario para la biocatálisis con células enteras ya que en los otros casos se alcanzó una transformación completa del precursor adicionado. La cepa obtenida constituye una herramienta promisoria y atractiva para su utilización en procesos productivos de alcaloides del tropano, factible de optimizarlos mediante la inmovilización de las células en matrices por inclusión para la reutilización el biocatalizador en ciclos sucesivos, incrementando la productividad del proceso. Asimismo, los hechos reportados en relación al cofactor limitante son muy interesantes ya que simplificaríanel sistema y permitirían reducir los costos del proceso.