Liberación de alcaloides del tropano por metil jasmonato y ciclodextrinas para la optimización del proceso productivo usando raíces transformadas

PERASSOLO, MARÍA; HEREDIA, MARÍA SOLANA; RODRÍGUEZ TALOU, JULIÁN; GIULIETTI, ANA MARÍA; CARDILLO, ALEJANDRA BEATRIZ

Santa Fe

Simposio; 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2014

Introducción Los alcaloides del tropano, tales como hiosciamina, 6b-hidroxihiosciamina y escopolamina, son un importante grupo de metabolitos secundarios producidos principalmente por plantas de la familia Solanaceae que han sido ampliamente utilizados en medicina debido a su acción anticolinérgica. En la actualidad estos alcaloides son extraídos a partir de la explotación de la fuente natural de producción dado que la síntesis química de los mismos presenta numerosas dificultades y es antieconómica [1]. La producción de alcaloides utilizando células vegetales siempre ha sido una opción atractiva y ampliamente estudiada como sistema de producción alternativo. Si bien uno de los principales inconvenientes de la producción de metabolitos secundarios suele ser su bajo rendimiento, este tipo de cultivos permite la aplicación de estrategias para aumentar su acumulación y/o su purificación. Una de estas estrategias es la elicitación, aplicada con considerable éxito con el fin de favorecer la acumulación de estos compuestos, ya sea empleando componentes celulares de un patógeno, agentes físicos o químicos, o elicitores endógenos como el Metil jasmonato (MeJ). Por otra parte, las ciclodextrinas (CD) han sido empleadas en la industria farmacéutica, biotecnológica y de alimentos con diversos fines, siendo uno de ellos favorecer la acumulación de metabolitos secundarios. Recientemente, se ha demostrado que no sólo tienen un efecto elicitor en cultivos in vitro, aumentando la producción dichos metabolitos, sino que también favorecen su liberación al medio de cultivo. El objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto del tratamiento con MeJ y con hidroxipropil-b-ciclodextrina (HPCD) en la producción de alcaloides del tropano en cultivos de raíces transformadas de Brugmansia candida. Metodología Establecimiento y cultivo de raíces transformadas de B. candida: Fueron obtenidas mediante la inoculación de hojas de 30 días de edad con Agrobacterium rhizogenes LBA 9402. Las raíces establecidas fueron mantenidas a 24ºC ± 2ºC en medio Gamborg B5/2 libre de hormonas suplementado con sacarosa 20 g/l y ampicilina 1 g/l. Cultivo y elicitación de raíces transformadas en Erlenmeyer: Se inocularon frascos de 100 ml conteniendo 20 ml de Gamborg B5/2 con 0,1 g peso fresco (PF) de raíces transformadas de 20 días de edad. Tabla 1: Diseño factorial completo para HPCD y MeJ Se realizaron dos ensayos con diseño factorial completo, combinando el agregado de MeJ con HPCD al día 14 de cultivo (Tabla 1). Extracción de alcaloides y análisis por HPLC: Las raíces fueron molidas en N2 líquido e incubadas en presencia de 5 ml de H2SO4 0,2 M. Las muestras obtenidas fueron llevadas a pH 12 con NaOH 1N para la extracción de los alcaloides con 5 ml de cloroformo. El análisis por HPLC se realizó con una columna Li-ChroCART 125-4 60RP-select B (5μm), Merck. La composición de la fase móvil utilizada fue: ácido octanesulfónico 0,01M pH3/Metanol (65:35 v/v) y se trabajó isocráticamente a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Resultados En ensayos previos, el tratamiento de raíces transformadas de B. candida utilizando MeJ en concentración final de 100 μM no resultó en un incremento significativo en la producción de los alcaloides deseados con respecto al control (datos no mostrados). En este trabajo se analizó el efecto de la combinación de MeJ con HPCD como elicitores. En la figura 1 se muestran los resultados correspondientes al contenido de alcaloides a los 0, 1, 5 y 8 días post-elicitación. Tanto el elicitor MeJ, HPCD como la combinación MeJ-HPCD indujeron un ligero incremento del contenido alcaloides a partir del día 1 post-elicitación. Adicionalmente, el tratamiento con la combinación MeJ-HPCD indujo la liberación de hiosciamina, 6b-hidroxihiosciamina y escopolamina al medio. Tal como se muestra en la figura 2, la liberación de los alcaloides al medio fue significativa respecto al comportamiento observado por los cultivos control y los cultivos elicitados con MeJ a partir del día 5. Este hecho reviste una importancia tecnológica interesante ya que la liberación inducida de alcaloides al medio favorecería las etapas de extracción y purificación de los mismos. Asimismo, esta característica resulta de gran utilidad para la producción de alcaloides del tropano mediante cultivos de raíces transformadas en biorreactores [2]. Existen antecedentes en nuestro laboratorio del escalado de estos cultivos en biorreactores adaptados para tal fin [2]. Actualmente se están realizando ensayos con el objeto de aplicar la estrategia de elicitación con MeJ-HPCD en cultivos de raíces en biorreactores modificados. Conclusiones La elicitación con MeJ 200 μM, solo y en combinación con HPCD, incrementó el contenido de alcaloides del tropano en cultivos de raíces transformadas de B. candida desde el día 1 post-elicitación. Asimismo, la combinación MeJ-HPCD indujo la liberación de hiosciamina, 6β-hidroxihiosciamina y escopolamina al medio de cultivo. Estos hechos son de interés ya que los alcaloides del tropano tienen una escasa liberación al medio, lo cual dificulta las etapas de extracción y purificación de alcaloides. La liberación de los alcaloides al medio puede aportar ventajas importantes ante el desarrollo de un proceso de producción de alcaloides mediante cultivos de raíces transformadas en biorreactores ya que simplificará las etapas de extracción y purificación de los mismos. Referencias [1] Oksman-Caldentey K-M. Current Pharmaceutical Biotechnology 2007, 8:203-210. [2] Cardillo AB, Otalvaro AM, Busto VD, Rodríguez Talou J, Velásquez ME, Giulietti AM. Process Biochemistry 2010, 45:1577-1581.