Estrategias de optimización de vectores Adenovirales recombinantes para mediar la generación de partículas similares al virus de la Fiebre Aftosa

ZIRALDO, MICAELA; MATTION, NORA; GONZÁLEZ, MAURO; D'ANTUONO, ALEJANDRA; NUÑEZ, DENISE ANABEL

CABA

Jornada; IX Jornadas de Jóvenes Investigadores; 2019

Facultad de Ciencias Veterinarias - UBA

Considerada por la Organización Mundial de Sanidad Animal como la principalenfermedad animal de declaración obligatoria, la fiebre aftosa (FA) es una enfermedad queafecta a una amplia variedad de animales biungulados, cuyo agente etiológico es el virus dela fiebre aftosa (VFA). Dados los recientes brotes en países libres de FA, causantes decuantiosas pérdidas económicas, existe un continuo interés en desarrollar vacunas que noestén basadas en el cultivo de VFA infectivo. En ese sentido las partículas tipo virus (PTV),desprovistas del genoma viral, se presentan como inmunógenos atractivos ya queconservarían todo el repertorio de epitopes conformacionales del virus salvaje. Nuestrolaboratorio desarrolló un vector derivado de Adenovirus (Ad) que porta un cassette queexpresa la poliproteína P12A-3C, que incluye las proteínas que conforman la cápside delVFA cepa O1 Campos más la proteasa viral 3C (AdOP). El análisis de las subunidadesgeneradas reveló que las proteínas virales estructurales se asocian formando un complejomacromolecular con velocidad de sedimentación intermedia entre las subunidades 75S(PTV) y 12S (capsómeros) del VFA. Así el objetivo de este trabajo fue generar un nuevoAd que favorezca el ensamblado de PTV del VFA. Para conseguirlo, se introdujeronmutaciones puntuales en la secuencia que codifica la proteína capsidal VP2, queestabilizarían la interfaz entre los protómeros que conforman la cápside viral, y mutacionesen la secuencia de la proteasa viral 3C, que disminuirían su actividad proteolítica,favoreciendo la sobrevivencia de las células huéspedes. De esta forma se generaron elgenoma pAdOP[VP2S93F/Y98F] que porta la mutación doble S93F/Y98F en VP2 y losgenomas pAdOP[3CC142S] y pAdOP[3CG38S/F48S] que portan las mutaciones C142S yG38S/F48S, respectivamente, en 3C. Por medio de experimentos de Western blot de lisadosde células transfectadas, se verificó que los nuevos vectores dirigen la expresión y elcorrecto procesamiento de las proteínas estructurales VP1 y VP3. A continuación, serescataron exitosamente cada uno de los Ad y se evaluó su capacidad de dirigir elensamblado en PTV de las proteínas heterólogas del VFA. Para ello, se procesaron porcentrifugación en gradientes de sacarosa extractos citoplasmáticos de células infectadas concada uno de los Ad y se analizaron las fracciones por ELISA. Estos experimentospermitieron identificar en los tres lisados un componente mayoritario con una velocidad desedimentación intermedia entre las subunidades 75S y 12S del VFA, pero lo más relevantefue que en el caso de AdOP[VP2S93F/Y98F] se observó un componente adicional con unavelocidad de sedimentación similar al de las cápsides vacías. En conclusión, los resultadosmuestran el vector AdOP[VP2S93F/Y98F] dirige la expresión de elevados niveles de proteínascapsidales del VFA, sugiriendo además que la presencia de la doble mutación en VP2favorecería el ensamblado de PTV por un fenómeno de estabilización de las mismas. Encambio no se encontró evidencia que las mutaciones en 3C favorezcan la formación dePTV.