FACTOR DE CRECIMIENTO NERVIOSO BETA (B;-NGF) Y SU RECEPTOR TRKA EN EL SISTEMA REPRODUCTOR DEL MACHO DE LLAMA. LOCALIZACIÓN EN ESPERMATOZOIDES.

SARI, LUCIANA; CARRETERO, M. IGNACIA; ZAMPINI, RENATO; FUMUSO, F; BARRAZA, D E; ARGAÑARAZ, MARTIN E.; RATTO, MARCELO; APICHELA, SILVANA A.

CABA

Jornada; V Jornadas Internacionales del INITRA; 2017

Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal

Nuestra hipótesis es que el β-NGF del plasma seminal de llama se adhiere a los espermatozoides durante la eyaculación. Nos propusimos: 1- Localizar β-NGF y su receptor TrkA en espermatozoides: I. epididimales (EE), II. eyaculados (EY) y III con reacción acrosomal (RA); y 2- Conocer el origen del β-NGF seminal analizando su expresión en el aparato reproductor masculino. Espermatozoides: El semen se obtuvo por electroeyaculación, bajo anestesia general, de machos de llama adultos de la FCVUBA. Luego se lavó dos veces en solución fisiológica a 37º C (1:10) (800 x g 10 min). Parte del pellet de espermatozoides fue fijado sobre portaobjetos positivados. El resto fue tratado para inducir RA: los espermatozoides se incubaron 3 hs a 38° C, 100% de humedad y 5% de CO2 en TALP-BSA 6 mg/ml. Luego, se agregó ionóforo de calcio 5 µM (A23187) y se incubó 1 h. Se evaluó viabilidad y estado acrosomal con FITCPNA/PI. Se realizaron frotis que se fijaron en Carnoy para inmunomarcación. Los EE se obtuvieron post mortem en Tucumán. Se realizó disección de la cola del epididimo, lavado de los espermatozoides y frotis. Inmunofluorescencia: Los frotis de EE, EY y espermatozoides con RA se incubaron con Proteinasa K 2% (20 min a 37° C) y luego Tritón X-100 0,3%. Se bloqueó con BSA 1% (30 min a TA). Se incubó con anti-βNGF 1:200 o anti-TrkA 1:100, 3 hs a 37° C y luego con anticuerpo secundario biotinilado, 1:200 (20 min a TA) y con extravidina-FITC (1:2000). Se observó en microscopio de fluorescencia. RT-PCR: testículo, glándulas bulbouretrales, próstata y cabeza, cuerpo y cola del epidídimo se obtuvieron post mortem y se procesaron para extracción de ARN total. El ADNc se obtuvo por transcripción reversa de 1 µg de ARN con M -MLV y oligodT. Se diseñaron cebadores específicos para β-NGF y TrkA y se realizó PCR con 0,5 µl de ADNc. Como gen de referencia se empleó β-actina. Los productos se visualizaron en gel de agarosa al 1,5% y se calculó su expresión relativa por ImageJ. Para el análisis estadístico se aplicó ANOVA y test LSD de Fisher mediante InfoStat. Ambas proteínas se localizaron en la pieza media del espermatozoide. Sólo los EE y los espermatozoides RA poseen marca de β-NGF, mientras para TrkA se observó marca en los 3 casos. Se observó expresión génica de β-NGF y TrkA en todo el aparato reproductor siendo mayor en próstata y cabeza del epidídimo para β-NGF. Se concluye que el plasma seminal aportaría el β-NGF al espermatozoide durante la eyaculación. La co-localización de β-NGF y de su receptor indicaría que β-NGF ejerce alguna acción sobre el espermatozoide. La co-expresión de factor y receptor en el aparato reproductor podría indicar que, además de ser secretado, el β-NGF cumple también funciones en el órgano de producción.