Propiedades inhibitorias de lactobacilos de criaderos de R. catesbeiana

PASTERIS S.E.; VERA PINGITORE E.; ROIG BABOT G.; BÜHLER M.I; NADER-MACIAS M.E.

Buenos Aires - Argentina

Congreso; BairesBiotech 2005; 2005

(10) Propiedades inhibitorias de lactobacilos de criaderos de R. catesbeiana Sergio E. Pasteris1, Esteban Vera Pingitore1, Germán Roig Babot1, Marta Bühler1 y María Elena Nader-Macías2 1 INSIBIO – Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, Universidad Nacional de Tucumán y 2Centro de Referencia par Lactobacilos (CERELA-CONICET). Chacabuco 461. C.P. 4000. San Miguel de Tucumán. Argentina. E-mail: fnader@cerela.org.ar     Introducción Los cultivos probióticos han adquirido un gran auge en los últimos años tanto para ser utilizados en la industria alimenticia como para el control y prevención de enfermedades en el hombre y en animales homeo y poiquilotermos (Audisio, 2000; Ringo y Gatesoupe, 1998). En estos últimos tiene su principio de aplicación en la  acuicultura de peces (Nikoskelainen et al, 2000). La rana es considerada un producto de pesquería y tanto la carne como los subproductos de la faena son empleados en diferentes industrias. Estos aspectos hacen que la cría de R. catesbeiana sea un proceso intensivo con lo que se incrementa el riesgo de aparición de epizootias entre las que se destaca el síndrome de la pata roja (SPR).  En trabajos previos demostramos que algunas cepas de lactobacilos aisladas de diferentes sectores de un ranario tienen la propiedad de inhibir a patógenos asociados a SPR. Asimismo, que los lactobacilos no translocaron a hígado y bazo de los animales enfermos durante un episodio de SPR. Estos resultados nos indujeron a realizar el aislamiento y selección de un mayor números de microorganismos benéficos para evaluar sus propiedades antagónicas frente a patógenos de ranarios homólogos y heterólogos Metodología Microorganismos: los lactobacilos fueron aislados de un ranario del NOA durante los meses de Junio, Setiembre y Diciembre, teniendo en cuenta diferentes sectores del ranario: agua de piletas donde los especimenes cumplen sus respectivos ciclos biológicos, piel de animales sanos y enfermos con SPR y muestras de alimento balanceado. En los microorganismos aislados se realizó el relevamiento de propiedades antagónicas. Condiciones de cultivo: las cepas de lactobacilos seleccionadas fueron desarrolladas en caldo LAPTg durante  24 hs a 37°C mientras que las cepas indicadoras (Proteus vulgaris, Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp 4a y 20a) fueron crecidas en medio caldo nutritivo durante 24 hs a 37°C. Actividad antimicrobiana: los sobrenadantes de cultivos de lactobacilos fueron neutralizados y tratados con catalasa y enfrentados a cultivos activos de cepas indicadoras utilizando el método de difusión en placas en agar blando. Las placas se incubaron durante 24 hs a 37°C  y la actividad antagónica se expresó en mm de halo de inhibición. Producción de peróxido de hidrógeno: se evaluó en medio MRS adicionado con TMB y peroxidasa (Juárez Tomás et al., 2004). La producción del metabolito se evidencia por la presencia de colonias pigmentadas (entre marrón y azul). Resultados y Discusión La mayoría de las cepas de lactobacilos seleccionadas fueron capaces de inhibir el desarrollo de los patógenos tal como se detalla para los microorganismos aislados de piel de animales sanos, agua y alimento balanceado (tablas 1, 2 y 3). La capacidad inhibitoria detectada por el método de placas de agar es inversamente proporcional a la concentración inicial de los cultivos indicadores y en todos los casos es por producción de ácidos orgánicos ya que en los sobrenadantes posneutralización y tratados con catalasa no se detectó actividad inhibitoria. Tabla 1.- Actividad antimicrobiana de cepas de lactobacilos seleccionadas de piel de animales sanos. Cepa Halos de inhibición (mm)   P.  vulgaris Ps. aeruginosa C. freundii 6E - - - Sep 11c 2* 2* - Sep 2b 3 6 2 Sep 10b 1* 2* 2* Sep 35b 1 1 1 Sep 36b 2* 3 2 7m 1 1* 2* GST 27 1 1 1 2R - - - 2T - - - 2W - - - *halo difuso  Tabla 2.- Actividad antimicrobiana de cepas de lactobacilos seleccionadas de agua de animales sanos. Cepa Halos de inhibición (mm)   P.  vulgaris Ps. aeruginosa C. freundii FZ 17 3* - - FZ 17¨ 5* 9 - GST22b - - - GST13 1* 2 - *halo difuso. Tabla 3.- Actividad antimicrobiana de cepas de lactobacilos seleccionadas de alimento balanceado. Cepa Halos de inhibición (mm)   P. vulgaris* Ps. aeruginosa C. freundii 8d 1* 1* - 9c 3* 4 - 9d 1 3 - 9e 1* 2 - 9k 2* 2 - 9o 2* 2 - 9p 2* 1 - 9v 3 4 - *halo difuso La producción de H2O2 evaluada en un total de 77 cepas de lactobacilos se evidenció solamente en 8 que fueron altamente productoras de este metabolito, si bien algunas de ellas no fueron capaces de inhibir el crecimiento de patógenos asociados a SPR, que es el caso de las cepas 6E, 2R, 2T, 2W (aisladas de animales sanos). Otro ejemplo es la cepa GST 22b, aislada de agua de piletones. En relación a las cepas aisladas de alimento balanceado, se observó entre ellas un perfil inhibitorio semejante sobre patógenos de ranarios, siendo buenas productoras de H2O2. Conclusiones - La mayoría de las cepas seleccionadas produjeron inhibición a patógenos de ranarios. Solamente algunas cepas aisladas de piel de animales sanos no fueron capaces de inhibir a C. freundii, efecto que no se observa sobre los otros patógenos relacionados a SPR tales como Pr. vulgaris y Ps. aeruginosa. -No se detectaron cepas productoras de bacteriocinas y/o diacetilo, en las condiciones de ensayo. - Se destaca que solo una cepa de Lactobacillus aislada de animal enfermo fue capaz de producir peróxido de hidrógeno y de inhibir a Pr. vulgaris  y Ps. aeruginosa simultáneamente. -Estos resultados constituyen una herramienta importante para la selección de lactobacilos a ser empleados en el diseño de un producto probiótico para ser aplicados en criaderos de ranas, lo cual redundaría positivamente disminuyendo los costos de producción por la menor incidencia de epizootias. Por otra parte, permitiría la participación de nuestro país en el mercado con productos de calidad. Referencias bibliográficas Audisio, C. (2000). Tesis Doctoral. Universidad Nacional de Tucumán. Juarez Tomás, M. et al (2004). Humana Press. Ed: Frank Spencer and Alicia Ragout. 268: 337-346. Nikoskelainen et al (2001). Applied and Environmental  Microbiology. 67 (6): 2430-2436. Ringo E. y Gatesoupe E.J. (1998). Aquaculture. 160:177-203.