AISLAMIENTO DE COMPUESTOS CON ACTIVIDAD ANTI-TIROSINASA DE UN EXTRACTO DE LEPECHINIA MEYENII

MARÍA INÉS CRESPO

San Juan

Congreso; I CONGRESO BINACIONAL DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA - V ENCUENTRO DE JÓVENES INVESTIGADORES; 2017

La enzima tirosinasa (EC 1.14.18.1), también llamada polifenoloxidasa, es una metaloproteína contenedora de iones cobre en su sitio activo ampliamente distribuida en mamíferos, artrópodos, plantas y microorganismos. Dicha enzima cataliza las dos primeras reacciones en la biosíntesis de melanina: la hidroxilación de L-tirosina a L-DOPA (actividad monofenolasa) y la posterior oxidación de esta última a dopaquinona (actividad difenolasa)1. En humanos la presencia de melanina es fundamental para la protección de la radiación UV y remoción de especies reactivas de oxígeno. Sin embargo, su acumulación deriva en patologías de hiperpigmentación (por sobre-expresión de la enzima) como manchas, pecas, melasma y melanoma maligno2,3. A su vez tirosinasa está relacionada con la formación de neuromelanina y tiene la capacidad de producir neurotoxicidad a través de la síntesis de dopamin-quinonas lo que contribuye a la neurodegeneración asociada con la enfermedad de Parkinson4. En adición, varios microorganismos tienen la capacidad de producir melanina cuya función principal está relacionada a la supervivencia de los mismos en diversas condiciones ambientales. Tal es el caso de la melanización de algunas levaduras lo que conduce a una reducida fagocitosis por los macrófagos, contribuyendo al desarrollo de la infección5. Nuevos descubrimientos indican además que la melanina también se asocia a la rigidez estructural de las paredes de las células6. Por otro lado, este pigmento presenta la propiedad de unirse a ciertos antibióticos y antifúngicos disminuyendo su efectividad7. La inhibición de tirosinasa resulta ser entonces una importante estrategia para obtener nuevos agentes terapéuticos y cosméticos que permitan tratar trastornos de hiperpigmentación. Además, dicha inhibición presenta utilidad en el control de insectos y microorganismos y permite evitar el pardeamiento enzimático de frutas, verduras y crustáceos. Actualmente existen drogas comerciales inhibidoras de tirosinasa como hidroquinona, ácido kójico y corticoesteroides, sin embargo estos agentes presentan diversos efectos adversos como dermatitis e irritación8, destrucción de melanocitos9, ocronosis, citotoxicidad y desarrollo de cáncer de piel10. Debido a estos inconvenientes, la búsqueda de nuevos agentes con capacidad bloqueante de la melanogénesis es un tema prioritario para la academia y la industriaEl hecho de encontrar descriptas en la bibliografía diversas moléculas con capacidad inhibidora de tirosinasa obtenidas a partir de plantas, incentivó a que en nuestro laboratorio se buscaran compuestos activos en extractos etanólicos de 92 especies nativas del centro de Argentina recogidas en las sierras de Córdoba. Para esto se realizó un screening de actividad utilizando la técnica de dopacromo, el cual demostró que Lepechinia meyenii poseía una marcada propiedad inhibitoria de la actividad monofenolasa de la enzima con una IC50 de 10,43 μg/ml11.Con el objetivo de poder elucidar la estructura molecular del o de los principios activos responsables de la inhibición de la enzima tirosinasa, se realizó un aislamiento bioguiado a partir del extracto etanólico de Lepechinia meyenii. Para ello se realizaron fraccionamientos sucesivos utilizando diferentes técnicas cromatográficas con silica gel 60 (cromatografía líquida en vacío, en columna, en capa delgada preparativa, cromatotrón, entre otros) y Sephadex LH20. Luego de cada separación se constató por la técnica de dopacromo la actividad de cada una de las fracciones obtenidas a 50 y 25 μg/ml. Para comenzar con el aislamiento bioguiado del extracto etanólico de L. meyenii (Figura 1), se realizó una cromatografía líquida en vacío (VLC) utilizando como fase móvil los siguientes solventes puros o en mezclas binarias, en orden creciente de polaridad: hexano, éter etílico, acetato de etilo y metanol. Luego de una evaluación de las 13 fracciones obtenidas por cromatografía de capa delgada (TLC), se confirmó que las mismas contenían compuestos diferentes con polaridades consecuentes a los solventes utilizados. Sin embargo, cuando se evaluó su capacidad inhibitoria de tirosinasa, se observó que muchas de las fracciones obtenidas presentaban más del 90 % de inhibición aun cuando poseían perfiles de TLC muy dispares. La fracción activa F3 fue eluída con la mezcla hexano/éter etílico 30:70, mientras que las otras (F7 a F13) fueron eluídas con mezclas de solventes más polares, partiendo de la mezcla éter etílico/acetato de etilo 50:50 a metanol 100. A partir de estos resultados se infirió que la actividad inhibitoria observada en extracto completo de L. meyenii era debida a más de un compuesto activo. A partir de las fracciones activas obtenidas se realizaron sucesivas separaciones cromatográficas para aislar los compuestos responsables. Figura 1: Fraccionamiento bioguiado del extracto etanólico de L. Meyenii. Se indican los porcentajes de inhibición de la actividad monofenolasa de tirosinasa, evaluados a 50 µg/ml/25 µg/ml mediante la técnica de dopacromo para cada fracción. En el caso de conjuntos de fracciones se muestra un promedio entre los valores obtenidos. Para continuar con el aislamiento de la fracción F3, se realizaron dos columnas con silica gel 60 y una posterior cromatografía en placa preparativa lo cual permitió obtener la fracción llamada FR3. Dicha fracción presentó 100% y 54% de inhibición de tirosinasa a 50 y 25 μg/ml respectivamente. Para identificar cuál de los compuestos presentes en FR3 era el que poseía actividad anti-tirosinasa, se realizó una TLC con cloroformo/éter etílico 70:30 como fase móvil y se evaluó la actividad de la enzima sobre la placa cromatográfica. De esta manera se identificó un compuesto con un Rf=0,47, visible con lámpara UV. Un estudio preliminar en HPLC-DAD utilizando acetonitrilo/agua 60:40 como fase móvil mostró dos señales (6,01 y 8,25 minutos) las cuales presentaron espectros UV-visibles muy similares con máximos de absorción (λmáx) a 195 y 210 nm. Actualmente se repite su aislamiento con el objeto de obtener masa suficiente para realizar la identificación del compuesto mediante resonancia magnética nuclear (NMR). Posteriormente se procesaron F8 y F9. Para ello se realizó una nueva VLC obteniendo cinco nuevas fracciones con marcadas diferencias en sus componentes. Sin embargo, cuatro de ellas mostraron una gran actividad inhibitoria ante tirosinasa. En primer lugar se seleccionó la fracción Hex/Eter para realizar una cromatografía en columna con Sephadex? LH20. Cuando se evaluó la actividad de las 18 muestras obtenidas, se observó inhibición de la enzima en dos fracciones consecutivas, cuyos porcentajes de inhibición a 50 y 25 μg/ml fueron los siguientes: fracción HE14 100%/95% y fracción HE15 100%/92%. La evaluación de dichas fracciones utilizando un HPLC-DAD (fase móvil: metanol/agua 50:50 con 0,05 % acido perclórico) permitió observar que la fracción HE15 presentaba un 90 % de pureza (una señal a 4,40 min λmáx: 323/218/235 nm). Luego de un análisis de la muestra por NMR, el compuesto activo fue identificado como ácido cafeico. La concentración inhibitoria media (IC50) del ácido cafeico fue 1,8 (0,3-4,3) μM. Por otra parte la fracción HE14 presentó dos señales cuyos tiempo de retención fueron los siguientes: 4,22 min λmáx: 205/231/280/312 (compuesto A) y 6,63 min λmáx: 308/210/225 (compuesto B). Estos compuestos fueron separados utilizando cromatografía en placa preparativa utilizando como fase móvil hexano/éter 30:70 con 5% ácido acético. Ambos compuestos resultaron activos, los porcentajes de inhibición obtenidos a 25 y 12,5 μg/ml fueron 100% y 74% para A, 100% y 100% para B respectivamente. Actualmente se está repitiendo el aislamiento de ambos para poder realizar estudios de NMR. En todo el aislamiento realizado hasta el momento, el compuesto B es el que ha mostrado mayor actividad. Actualmente se está procesando las fracciones ACN y Metanol de las cuales se espera obtener compuestos diferentes a los ya aislados.Los resultados obtenidos hasta el momento muestran que el extracto de Lepechinia meyenii posee al menos cuatro compuestos activos, uno de los cuales fue identificado como ácido cafeico quien ya tiene actividad antitirosinasa reportada12. La elucidación molecular de los mismos permitirá proponer a estos metabolitos como posibles nuevos agentes terapéuticos y cosméticos.1) Chang, T. S. Int J Mol Sci 10: 2440-75, (2009).2) Chen, Q. X. & Kubo, I. J Agric Food Chem 50: 4108-12, (2002).3) Prezioso, J. A., Epperly, M. W., Wang, N. & Bloomer, W. D. Cancer Lett 63: 73-9, (1992).4) Greggio, E. et al. J Neurochem 93: 246-56, (2005).5) Almeida-Paes, R. et al. Microbes Infect 11: 554-62, (2009).6) Gauwerky, K., Borelli, C. & Korting, H. C. Drug Discov Today 14: 214-22, (2009).7) Nosanchuk, J. D. & Casadevall, A. Antimicrob Agents Chemother 50: 3519-28, (2006).8) Tocco, G. et al. Bioorg Med Chem Lett 19: 36-9, (2009).9) Chawla, S. et al. Br J Dermatol 159: 1267-74, (2008).10) Karioti, A., Protopappa, A., Megoulas, N. & Skaltsa, H. Bioorg Med Chem 15: 2708-14, (2007).11) Chiari, M. E., Joray, M. B., Ruiz, G., Palacios, S. M. & Carpinella, M. C. Food Chemistry 120: 10-14, (2010).12) Lee, H. S. J Agric Food Chem 50: 1400-3, (2002).