Efecto de una metaloproteinasa de veneno de serpiente del nordeste argentino sobre la agregación plaquetaria

VAN DE VELDE, ANDREA C.; LUQUE, DAIANA E.; GAY, CLAUDIA C.; FUSCO, LUCIANO S.

Resistencia

Jornada; XXV Comunicaciones Cientificas y Tecnologicas - 2019; 2019

Universidad Nacional del Nordeste

Los venenos de serpientes son una mezcla de proteínas y péptidos biológicamente activos, que actúan afectando la hemostasia por activación oinhibición de factores de la coagulación y de receptores plaquetarios, o bien por daño del endotelio mediante clivaje de componentes de la membranabasal. Las Metaloproteinasas de Venenos de Serpientes (SVMPs) constituyen la familia de proteínas más abundantes del veneno de Bothropsalternatus (yarará grande). Baltergina es una PIII SVMP, aislada de este veneno, con actividades proteolítica, hemorrágica, procoagulante ydesintegrina, capaz de unirse y bloquear integrinas de membrana. Luego de una injuria, la interacción del complejo plaquetario GPIb-IX-V con el factorde von Willebrand (FvW), y de la integrina a2b1 con el colágeno tipo I expuesto en la membrana basal, juegan un rol clave en la activación yagregación plaquetaria, convirtiéndose en blancos de acción de las SVMPs. El objetivo de este trabajo fue utilizar un método turbidimétrico,empleando lectora de microplacas, para evaluar el efecto de baltergina sobre la agregación plaquetaria. La enzima se purificó a partir del veneno deespecímenes adultos de B. alternatus por combinación de dos técnicas cromatográficas. Para obtener baltergina inactivada, se incubó con Na2EDTA(inhibidor), y el excedente de éste se eliminó por cromatografía de exclusión molecular. Se ensayó la actividad proteolítica, para comprobar la efectividaddel inhibidor, y se realizó la cuantificación de proteínas. Primeramente, se determinó la actividad procoagulante de la enzima utilizando plasma citratadoincubado con baltergina (0,007; 0,07; 0,35 y 0,7 μM) y se registraron los tiempos de coagulación (TC) utilizando un coagulómetro. Se obtuvo el PlasmaRico en Plaquetas (PRP) a partir de muestras de sangre citratada, centrifugando a bajas revoluciones y tomando los dos tercios inferiores. La fracciónsuperior restante se centrifugó a altas revoluciones, y del sobrenadante se obtuvo Plasma Pobre en Plaquetas (PPP). El PRP se incubó a 37°C condiferentes concentraciones de baltergina (0,007?0,07 μM) y baltergina-Na2EDTA (0,07 μM) durante 20 minutos para ristocetina (1,5 μg/ml) y 5 minutospara colágeno tipo I (5 μg/ml). Se registró la turbidez de la suspensión a 405 nm por 5 minutos a 37°C, con agitación constante, utilizando lectora demicroplacas y se calculó el porcentaje de agregación plaquetaria. Por último, se realizó el análisis estadístico de los datos mediante ANOVA siguiendoel test de Tukey con valores de p < 0,05. Se determinó la concentración máxima de baltergina a la cual el plasma no coagula y se decidió trabajar conconcentraciones menores o igual a 0,07 μM. Mediante el ensayo de agregación en lectora de microplacas, se demostró que la enzima, en unaconcentración de 0,07 μM, fue capaz de inhibir significativamente la agregación inducida por colágeno, obteniéndose valores de 30,67 ±2,13% y 57,49±0,50%, en presencia y ausencia de baltergina, respectivamente. El colágeno se une al receptor a2b1 presente en la superficie plaquetariadesencadenando el proceso de agregación. Baltergina podría unirse al dominio a2I del receptor evitando la unión del colágeno, como se demostró paraotras SVMPs, a través del su dominio símil desintegrina. Se comprobó además que baltergina (0,07 μM) inhibió significativamente la agregaciónplaquetaria mediada por ristocetina, obteniéndose valores de 56,59 ±1,25% y 77,05 ±0,16% en presencia y ausencia de la enzima, respectivamente.Este ensayo evalúa la unión del FvW al receptor GPIb-IX-V. Sin embargo, baltergina-Na2EDTA no modificó la agregación plaquetaria mediada por esteagonista (78,48 ±1,84%). En este caso, la actividad inhibidora podría deberse a la acción proteolítica de la enzima sobre el FvW o sobre su receptor,demostrando que el dominio catalítico de baltergina es fundamental en el efecto inhibitorio. En conclusión, se pudo demostrar que baltergina (0,07 μM)fue capaz de inhibir la agregación plaquetaria mediada por colágeno y ristocetina. Asimismo, en la agregación mediada por ristocetina se comprobó queel dominio catalítico de la enzima es el responsable de su acción inhibitoria. Estudios posteriores, utilizando factores y/o receptores plaquetariospodrán dilucidar el mecanismo molecular de acción de la metaloproteinasa y evaluar su potencial uso como agente antitrombótico.