IQUIBA-NEA   25617
INSTITUTO DE QUIMICA BASICA Y APLICADA DEL NORDESTE ARGENTINO
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Aislamiento de tripsina de ciegos pilóricos de pacú
Autor/es:
GOMEZ GABRIELA N; LEIVA, LAURA C; NERLI, BIBIANA B; ACEVEDO GOMEZ, ANTONELLA V
Lugar:
Corrientes
Reunión:
Jornada; XXIV Reunión de Comunicaciones Científicas y Tecnológicas de la UNNE; 2018
Institución organizadora:
Universidad Nacional del Nordeste
Resumen:
Piaractus mesopotamicus (pacú) es un pez incorporado al sistema productivo en la región NEA, y sus vísceras, que constituyen un material dedesecho, descartadas al medio pueden inducir problemas ambientales. Estas vísceras contienen numerosas enzimas digestivas, principalmenteproteasas. Una de ellas, la tripsina, es ampliamente utilizada en diversas industrias, como agroalimentarias, farmacéuticas, de detergentes,curtiembres y en la extracción de plata de placas radiográficas, entre otros usos. La aplicabilidad industrial de la tripsina deriva de la estabilidad yactividad que exhibe en condiciones adversas, como altas temperaturas, pH alcalino y presencia de tensioactivos y agentes oxidantes. Actualmente,su origen es bovino y porcino, siendo las vísceras de peces una fuente potencial para su obtención. Ensayos anteriores realizados en nuestrolaboratorio, sobre un extracto de ciegos pilóricos de pacú, demostraron la presencia de actividad tripsina y un comportamiento cinético y deestabilidad frente al pH con propiedades atractivas para su empleo industrial.El objetivo de este trabajo fue aislar una proteína con actividad tripsina a partir de material de desecho de la actividad ictícola, particularmente deciegos pilóricos de pacú.Muestras. Ciegos pilóricos de ejemplares de pacú, colectados en bolsas de plástico selladas y mantenidas a -20 °C hasta su utilización. Preparación delextracto alcalino. El tejido fue disgregado con buffer Tris-HCl 50mM, NaCl 0.5mM, CaCl2 20mM, pH 7.8 (buffer A), sonicado y centrifugado,recogiéndose el sobrenadante para estudios ulteriores.Actividad tripsina. Se determinó sobre el sustrato cromogénico BApNA (Na-benzoil-DL-arginina-P-nitroanilida), siguiendo la reacción por medición de laabsorbancia a 410 nm a través del tiempo en una lectora de microplacas termostatizada a 30°C.Aislamiento de tripsina. El extracto alcalino fue sembrado en una columna de afinidad de Benzamidine Sepharose, equilibrada con buffer A. Lasproteínas retenidas fueron eluídas con buffers a pH 4.5 y 3.2. Las fracciones obtenidas fueron monitoreadas a 280nm y testeadas con BAPNA.Electroforesis. Se empleó SDS-PAGE y tinción con plata para el análisis de peso molecular y pureza; y PAGE nativa y tinción con Coomassie blue parala actividad proteolítica sobre caseina.Actividad proteolítica sobre azocaseína. Se empleó para determinar la actividad de la tripsina aislada en el rango 0-75°C.El extracto obtenido a partir del procesamiento de ciegos pilóricos, mostró actividad sobre BAPNA positiva a pH 7.8, poniendo en evidencia la presenciade proteasas del tipo tripsina activas en medio alcalino. Esta muestra, aplicada a una columna de afinidad permitió la separación de proteínas en elextracto. Las proteínas no retenidas se descartaron. Para la elución de las proteínas que lograron interactuar con la columna se indujo un cambio en elpH del buffer eluyente mediante un proceso en etapas. A un pH de 4.5 se colectaron fracciones con un alto contenido proteico carentes de actividadsobre BAPNA. A pH más ácido (3.2) se detectaron 2 picos (A y B) con actividad sobre BAPNA positivos, donde B exhibió mayor actividad específicaque A. El control electroforético por SDS-PAGE de ambas fracciones mostró mayor grado de pureza para el pool de fracciones del pico B presentandouna banda única de masa molecular 21kDa, compatible con tripsinas de origen ictícola. La actividad proteolítica de la enzima fue evaluada porzimografía, donde se observó una banda clara, única (correspondiente a la hidrólisis de caseína). La tripsina aislada resultó activa en un amplio rango detemperatura (0-75°C), con un máximo de actividad a 45°C. A 75°C, la enzima retuvo alrededor del 50% de su actividad maxima, un 20% más que latripsina porcina comercial. Esto constituye una propiedad atractiva que permitiría usarla como aditivo en jabones comerciales.La enzima aislada, mostró tamaño y características cinéticas similares a numerosas tripsinas aisladas de diferentes especies de peces.En conclusión, la cromatografia de afinidad resultó ser un procedimiento adecuado para purificar con exito, en una sola etapa, la proteína de interés. Seobtuvo una enzima del tipo tripsina, activa y con pureza apropiada, a partir de ciegos pilóricos de pacú.