Informe científico técnico final

FELITTI, S.A.

2013-10-28/2017-07-30

1-17

Biológica

Produccion vegetal-Semillas

OBJETIVOS GENERALESLa apomixis es una forma natural de reproducción asexual por semillas. Este modoreproductivo permite la clonación natural por medio de semillas de genotiposadaptados a regiones ecológicas particulares. Dado que cualquier combinacióngenética que contenga el/los determinantes de la apomixis puede ser mantenida porinnumerables generaciones vía semillas, la transferencia del carácter a otras especiesde interés agronómico (maíz, arroz, sorgo, etc.) puede tener un enorme impacto en laagricultura. La comprensión del proceso de formación del endospermo es un aspectocrucial en la perspectiva de incorporar la apomixis a otras especies. Se ha invertidouna enorme cantidad de recursos para identificar los genes involucrados en laformación del embrión clonal en distintas especies apomícticas. Sin embargo, se hanrealizado muy pocos estudios tendientes a entender el desarrollo del endospermo enestos sistemas.Paspalum notatum es una especie utilizada como modelo en estudios de genéticareproductiva vegetal. La especie es multiploide incluyendo un citotipo diploide y variospoliploides: triploide (3x), tetraploide (4x), pentaploide (5x), hexaploide (6x) yoctoploide (8x). El citotipo 4x es el más frecuente y más ampliamente distribuidomientras que los demás poliploides son muy raros o han sido obtenidos en formaexperimental. El citotipo diploide es sexual y autoincompatible mientras que lospoliploides son apomícticos, pseudógamos y autofértiles. La formación delendospermo en los citotipos apomícticos no depende del aporte genómico 2:1(materno:paterno), típico de la mayoría de las angiospermas. De hecho, en lostetraploides el aporte materno cuadriplica al paterno, pero además se ha demostradoque forman semilla independientemente de la relación genómica 2m:1p, lo que nosucede en los 4x inducidos ni en los diploides sexuales. El objetivo general delpresente proyecto es caracterizar el transcriptoma durante la formación de semillasprovenientes de plantas apomícticas y sexuales de P. notatum, con particular énfasisen la identificación de genes asociados al desarrollo del endospermo. Los resultadosque se obtengan aportarán conocimientos para comprender el mecanismo por el cualeste sistema genera semillas independientemente de la estricta relación genómicamaterna y paterna (2m:1p) presente en la mayoría de las especies de gramíneas.OBJETIVOS ESPECÍFICOS E HIPÓTESIS DE TRABAJO2.1 Realizar cruzamientos entre genotipos tetraploides sexuales de origenexperimental, tetraploides apomícticos naturales y diploides naturales a fin de generarsemillas con distintos niveles de ploidía por las vías sexual y apomíctica.2.2 Estudiar del desarrollo del embrión y del endospermo mediante microscopíadiferencial de contraste de interferencia (DIC).2.3 Realizar un análisis del transcriptoma en el inicio del desarrollo del endospermo desemillas provenientes de apomixis y sexualidad.2.4 Comparar los patrones de expresión génica del endospermo con los diferentesniveles de ploidías que se obtengan (por ej: 3x, 4x, 5x, 6x, 9x, 10x).2.5 Identificar y aislar transcriptos (genes) específicos del desarrollo del endospermode semillas apomícticas.Objetivo específico 2.1. Realizar cruzamientos entre genotipos tetraploides sexualesde origen experimental, tetraploides apomícticos naturales y diploides naturales a finde generar semillas con distintos niveles de ploidía por las vías sexual y apomíctica.Se utilizará el siguiente material vegetal de la especie P. notatum:· Q4117: genotipo originario del estado de Río Grande do Sul, Brasil, tetraploide (2n= 4x = 40), apomíctico (Martínez et al., 2001).· Q3775: genotipo originario de Tamaulipas, México, tetraploide (2n = 4x = 40),apoimíctico (Martínez et al., 2001).· C4-4x: genotipo tetraploide sexual originado por duplicación cromosómica,mediante colchicina, de una semilla proveniente de una población diploide sexualde la localidad de Cayastá, Santa Fe (Quarín et al., 2001).· Q4188: genotipo tetraploide sexual de origen experimental, registrado ante elUSDA-USA (Quarín et al., 2003).· Q4084: se trata de una población diploide sexual, coleccionada en la localidad deCayastá, Santa Fe, y mantenida en cultivo en FCA-UNNE, Corrientes. Son variasplantas (genotipos) diploides, sexuales y alógamos por autoincompatibilidad.Algunos individuos están estudiados desde el punto de vista reproductivo enQuarín y colaboradores (2001).· Q4205: genotipo tetraploide sexual, obtenido por autopolinización de Q3664.· Tifton 9: genotipo diploide sexual recibido de Ann Blount, Univeristy of Florida,North Florida Research and Education Center, Marianna FL, USA.· C4-2x: genotipo diploide sexual de origen experimental proveniente de unapoblación diploide sexual de la localidad de Cayastá, Santa Fe (Quarín et al.,2001).· Q4086#5: genotipo tetraploide sexual derivado de la autofecundación de Q4086(tetraploide sexual facultativa).· Q4308: genotipo hexaploide apomíctico.A partir de estos materiales se realizarán cruzamientos experimentales de acuerdo a laTabla 1 a fin de obtener ovarios polinizados (por las vías sexual y apomíctica) condistintas combinaciones genómicas matera/paterna en el endospermo.Todos los cruzamientos se harán con castración previa en cámara húmeda tal comofue descrito por Burton (1948). Para iniciar los estudios moleculares se colectaránovarios a intervalos de tiempo específicos (3, 24 y 48 hs) luego de producida lapolinización.Se utilizará como control ARN obtenido a partir de ovarios del genotipo Q4117castrado y no polinizado. El patrón de expresión del mismo permitirá detectar siexisten genes que se expresan (o se silencian) cuando la pseudogamia no es posiblepor falta de polen. Esto también permitirá distinguir aquellos genes que se expresancuando no hay polen de los que se expresan (o se silencian) cuando la relación 2m:1pno se cumple. Por otra parte, se incluirán los mismos tipos de cruzamientos pero condistinto material; por ejemplo, para el cruzamiento tetraploide apomíctico por diploidese seleccionarán dos madres: Q4117 y Q3775. Estas combinaciones permitiránidentificar aquellos genes específicos que presenten expresión diferencial debida algenotipo pero que pueden no estar relacionados con el desarrollo del endospermo.La totalidad de los cruzamientos experimentales planteados en este proyecto seránllevados a cabo con la colaboración del Ing. Camilo Quarín y del Dr. Carlos Acuña enel IBONE, Corrientes. En dicho instituto se dispone de una de las colecciones degermoplasma más importantes de Sudamérica de especies del género Paspalum. Elgrupo de investigación del IBONE tiene una amplia experiencia en la identificación deplantas apomícticas y sexuales, y en la realización de cruzamientos y de análisisembriológicos y de citometría de flujo. En los casos que corresponda las plantas seránmultiplicadas por rizomas y mantenidas en macetas en el predio de la FCA-UNR.Objetivo específico 2.2. Estudiar del desarrollo del embrión y del endospermomediante microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC).Las inflorescencias obtenidas a partir de los distintos cruzamientos serán fijadas por24 horas en FAA (18 etanol 70%:1 formaldehído 37%:1 ácido acético glacial). Seaislarán los pistilos por disección de las flores y se los clarificará utilizando elprocedimiento descrito por Young y colaboradores (1979). Un mínimo de 20 óvulosobtenidos a partir de al menos dos inflorescencias serán analizados utilizandomicroscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC).Estos estudios permitirán la observación del desarrollo del endospermo y del embrióna tiempos específicos luego de la polinización. Se podrá determinar si ambos sedesarrollan de manera coordinada cuando contengan distintos niveles de ploidíaderivados de los cruzamientos planteados en el objetivo específico 2.1. Estasobservaciones permitirán también interpretar correctamente los datos de expresióngénica obtenidos por cDNA-AFLP.Los estudios utilizando microscopía DIC planteados en este proyecto serán llevados acabo con la colaboración del Ing. Camilo Quarín y del Dr. Carlos Acuña en el IBONE,Corrientes. En dicho instituto se dispone de un microscopio Leica DM2500 equipadocon accesorio DIC. Asimismo, dichos investigadores tienen una amplia experiencia enla utilización de esta técnica experimental.Objetivo específico 2.3. Realizar un análisis del transcriptoma en el inicio deldesarrollo del endospermo de semillas provenientes de apomixis y sexualidad.Se realizará una caracterización del transcriptoma durante el desarrollo delendospermo en P. notatum utilizando la metodología de cDNA-AFLP según elprotocolo descrito por Vuylsteke y colaboradores (2007) y Xiao y colaboradores(2009). Brevemente, la preparación de ARN total se realizará a partir de al menos 20ovarios provenientes de cada cruzamiento utilizando el kit comercial ?Total RNAIsolation System? (Promega). Se analizarán ovarios a distintos tiempos (3 hs, 24 hs y48 hs luego de la polinización) de manera de detectar diferencias en los inicios de laformación del endospermo. El ARN será utilizado como molde en reacciones de retrotranscripcióncon las enzimas transcriptasa reversa Superscript II (Invitrogen) y la DNApolimerasa I (Invitrogen) para obtener ADNc doble hebra. Luego se digerirá a losdistintos ADNcs con dos combinaciones de enzimas de restricción, CviAII/MseI oCviAII/TaqI (New England Biolabs), se purificarán los fragmentos digeridos y se losligará a los adaptadores correspondientes (Vuylsteke et al., 2007). Posteriormente, seprocederá a la pre-amplificación seguida de la amplificación selectiva con distintascombinaciones de cebadores (Xiao et al., 2009). Los fragmentos de amplificaciónobtenidos serán separados en geles de acrilamida y visualizados mediante tinción conAgNO3.Un aspecto importante del diseño experimental de la técnica de cDNA-AFLP es elporcentaje del transcriptoma que se puede analizar. El factor determinante en estecaso es la selección de la combinación de enzimas de restricción utilizada para digerira los ADNcs. Se recomienda el uso de al menos una enzima de restricción de cortefrecuente (sitio de reconocimiento de 4 bases) dado que las mismas cortan a un grannúmero de los ADNcs que componen el transcriptoma. Sin embargo, estas enzimasoriginan fragmentos relativamente cortos. Por este motivo también se utilizan enzimasque reconocen sitios de 5 o 6 bases, las que producen cortes menos frecuentemente(en promedio se estima que menos de la mitad de los ADNcs están cubiertos) perogeneran fragmentos más largos y por lo tanto, más informativos.En el caso de P. notatum, se dispone de un número relativamente bajo de secuenciasde transcriptos (aproximadamente 106 secuencias considerando las contenidas enbases de datos públicas y otras obtenidas por nuestro grupo). Se realizó un análisis insilico con el objetivo de obtener un porcentaje de los sitios de corte de las distintasenzimas de restricción presentes en los transcriptos disponibles. Para ello se empleóel programa AFLPinSilico (Rombauts et al., 2003) y se analizó en primer lugar lafrecuencia de los cortes de cada enzima por separado y luego la de las combinacionesde aquellas que cortaban a un mayor porcentaje de secuencias. Como resultado deeste estudio, se seleccionaron dos combinaciones de enzimas de restricción paraanalizar el transcriptoma de semillas de P. notatum: CviAII/MseI y CviAII/TaqI. El parCviAII/MseI presentó sitios de corte en 24 transcriptos (22,6 %) mientras que el parCviAII/TaqI reconoció a 28 secuencias (26,4 %). Los datos obtenidos están enconcordancia con la información publicada por otros autores para especiesrelacionadas. Stölting y colaboradores (2009) estudiaron el efecto de las enzimas derestricción utilizadas en experimentos de cDNA-AFLP sobre el porcentaje desecuencias identificadas en cada caso. Para dicho estudio utilizaron transcriptos de 92especies de eucariotas disponibles en bases de datos públicas. Dichos autoresdeterminaron que la mejor combinación para las especies analizadas másrelacionadas evolutivamente con P. notatum (arroz, sorgo, trigo y maíz) es CviAII/TaqI.Los adaptadores y cebadores para la pre-amplificación y las amplificaciones selectivasque se utilizarán en este proyecto serán diseñados conteniendo los sitios para lasenzimas mencionadas más arriba.La Dra. Silvina Felitti, investigadora responsable de la presente propuesta, cuenta conuna amplia experiencia en estudios de expresión de genes y de transcriptómica (verpublicaciones). Además, ha realizado la puesta a punto de la técnica de cDNA-AFLPen el laboratorio de Biología Molecular de la FCA-UNR. Este protocolo está siendoutilizado exitosamente por varios grupos de investigación de dicha institución.Objetivo específico 2.4. Comparar los patrones de expresión génica del endospermocon diferentes ploidías que se obtengan (por ej: 3x, 4x, 5x, 6x, 9x y 10x).Se compararán los perfiles de amplificación de ovarios polinizados derivados degenotipos apomícticos y sexuales (Tabla 1) en geles de poliacrilamida. Se buscaráidentificar transcriptos de expresión diferencial en endospermos con distintascombinaciones genómicas matera/paterna provenientes de los cruzamientos descritosanteriormente. Los fragmentos que se obtengan serán aislados a partir de los geles depoliacrilamida, re-amplificados, clonados en el vector pGEM-T Easy (Promega) ysecuenciados.Se confirmarán los patrones de expresión de los genes seleccionados medianteexperimentos de PCR en tiempo real. Para ello se diseñarán oligonucleótidosespecíficos para las secuencias caracterizadas y se los utilizará como cebadores enreacciones de amplificación empleando un equipo RotorGene Q disponible en elLaboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Agrarias (UNR) deZavalla.Tanto en su doctorado como en su postdoctorado la Dra. Silvina Felitti ha realizadoestudios de expresión de genes. Durante su postdoctorado en Australia participó de laelaboración de bases de datos de genómica y transcriptómica. Recientemente hapublicado un trabajo en el que utilizó la técnica de PCR en tiempo real (Felitti et al.,2011).Objetivo específico 2.5. Identificar y aislar genes específicos del desarrollo delendospermo de semillas apomícticas.Las secuencias obtenidas serán comparadas con las que se encuentran disponiblesen bases de datos públicas (GenBank, Gramene, etc.) mediante búsquedas Blast. Enfunción de las homologías de secuencia que se detecten se clasificará a las mismasen categorías funcionales.Con el objetivo de obtener los genes completos correspondientes a los fragmentos queresulten de interés, se diseñarán oligonucleótidos específicos para cada extremo dedichos amplicones. Estos cebadores serán utilizados en experimentos de RACEutilizando bibliotecas no clonadas de tipo Marathon (Clontech) para los genotiposQ4117 y Q4188 disponibles en nuestro laboratorio. Los clones serán secuenciados afin de inferir la presencia de posibles genes candidatos relacionados con el desarrollodel endospermo.