Aproximación preliminar al mapeo por ligamiento del primer gen identificado como responsable de la resistencia a Diaporthe phaseolorum var. caulivora

MALONE, G.; PIOLI, R.N.; PERUZZO, A.M.; FERRARI, B.; HERNANDEZ, F.E.; PRATTA, G.R.

Rosario

Congreso; 7° Congreso de la Soja Mercosur MERCOSOJA 2019; 2019

Asociación de la Cadena de la Soja Argentina (ACSOJA)

La soja (Glycine max) es uno de los principales cultivos oleaginosos del mundo y una fuente importante de proteínas vegetales para el consumo. En el ciclo 2018/2019 la perspectiva de producción mundial fue de más de 350 millones de toneladas, siendo Brasil (32,3%), los EE.UU. (31,2%) y Argentina (15,5%) los principales productores (USDA, 2019). La agricultura moderna requiere estrategias que incrementen la productividad de manera sustentable con el ambiente y la calidad de vida urbana y rural. Siendo las enfermedades un factor limitante para el rendimiento y la calidad del grano y semillas de soja, la incorporación de resistencia durable constituye una estrategia eficaz para reducir el daño causado por las patologías que afectan al cultivo. Entre las más relevantes, se destaca la cancrosis del tallo de soja (CTS) causada por Diaporthe phaseolorum (anamorfo Phomopsis phaseoli) en sus dos variedades: meridionalis (CTS-Dpm) y caulivora (CTS-Dpc) (Fernández et al., 1996; Pioli et al., 2003; Peruzzo et al., 2019). El análisis de la resistencia a la CTS, iniciada en EE.UU. (en los ?80), determinó cuatro genes dominantes independientes y de herencia simple. Estos genes no alélicos fueron denominados: Rdc1 y Rdc2 en el cv. Tracy M (Kilen et al., 1987), Rdc3 y Rdc4 en los cvs. Crockett y Dowling, respectivamente (Bowers, 1993); y Rdc4 en el cv. Hutcheson (Tyler, 1996). Sin embargo, en base a estudios y resultados posteriores, tales genes fueron redenominados por sus respectivos Rdm1-Rdm4 ya que los estudios habían sido realizados sobre interacciones con aislamientos de Dpm resultando inefectivos para CTS-Dpc (Pioli et al., 2002a y 2002b).Respecto a CTS-Dpc, entre 1997 y 2008 se evaluaron 137 genotipos de soja mediante bioensayos de inoculaciones en invernaderos con aislamientos de Dpc de diferentes agro-ambientes, y sus controles sin inocular (con o sin heridas) (Pioli et al., 2003; 2006; 2009; Peruzzo et al., 2008; Benavidez et al., 2010). Se seleccionaron 20 genotipos de soja por su estabilidad en el comportamiento de resistencia (R) / susceptibilidad (S) frente a distintas cepas causales de CTS-Dpc. Luego de dos años de validar la reacción de estos genotipos frente a 4 cepas de Dpc, se discriminaron 3 fuentes de resistencia (Pioli et al., 2012) y 24 genotipos en dos grupos con comportamiento extremo, 12 para R y 12 para S (López Achaval et al., 2014). En este contexto, se logró avanzar en la identificación de al menos un gen de resistencia identificado como Rdc1, a través de técnicas básicas de mejoramiento (cruzamientos resistentes x susceptibles, obtención y evaluación de sus filiales F1 y segregantes F2:3 y F3) combinadas con validaciones moleculares tempranas (filiales F1) del proceso de selección. En una primera instancia se evaluó si este gen se encontraba ligado al color de flor, atributo que se utilizó como marcador fenotípico, descartándose esta posibilidad (Peruzzo et al., 2019). Por ello, resulta relevante disponer de marcadores moleculares (MM) ligados al gen Rdc1, lo que mejoraría la eficiencia de la obtención de cultivares con resistencia a la CTS-Dpc en los programas de mejoramiento. La ventaja de la incorporación de este tipo de marcadores consiste en que presentan un alto número, no son influenciables por el ambiente y son selectivamente neutros. Particularmente, los MM codominantes del tipo Polimorfismos de Nucleótido Único (SNPs) permiten relacionar los perfiles de polimorfismo molecular y fenotípico frente a CTS-Dpc en generaciones tempranas. Si bien ya se conoce su ubicación en el cromosoma de la soja, es necesario realizar al menos un mapa marco (framemap) de la generación F2 que se evalúa, a fin de ubicar luego en ese mapa al gen de interés. Por lo tanto, los objetivos de este trabajo fueron: a) generar un mapa marco para la generación F2 derivada del cruzamiento entre Ge13-R x Ge4-S, en la que se identificó a Rdc1; b) detectar cosegregación entre los marcadores localizados en el mapa marco y el gen Rdc1.Material vegetal: se utilizaron74 individuos F2 obtenidos a partir del cruzamiento Ge13-R x Ge4-S, cuyas familias F2:3 derivadas fueron inoculadas con un aislamiento de Dpc y caracterizadas en su reacción fenotípica frente a la enfermedad (pruebas de progenie), identificándose como R, segregantes y S en una relación 21:42:11, respectivamente, y ajustando a una segregación 1:2:1 en proporciones genotípicas (Peruzzo et al., 2019).Extracción de ADN: durante el período vegetativo de las plantas F2 se tomaron muestras de ocho discos de hojas sanas en estadio fenológico V3 (segunda hoja trifoliada expandida), incluyéndose además discos de material vegetal de las plantas progenitoras como referencia genotípica. Las muestras de tejido fueron rotuladas y almacenadas en freezer a -80ºC hasta su procesamiento (liofilizado). La extracción de ADN genómico se realizó de acuerdo al protocolo propuesto por Semagn et al. (2014).Análisis de la población F2 por SNPs: se realizó un análisis de la población F2 completa utilizando el método de genotipado por secuenciación a través de la técnica Agriseq (AgriSeqTM, Thermo Fisher Scientific). Para ello se realizó una PCR Multiplex que incluyo 1135 cebadores de tipo SNPs. La reacción de PCR se llevó a cabo con 7μL de mastermix, que incluía a los buffers, la Taq polimerasa y los DNTPs. Se incorporaron además 3μL de ADN genómico de cada individuo. Posteriormente, los amplicones fueron digeridos con endonucleasa de restricción y ligados a adaptadores específicos para cada individuo F2 (barcodes) (Baird et al., 2008).Mapeo del gen Rdc: con los SNPs evaluados se construyó un mapa de ligamiento a través del Programa MapDisto (Heffelfinger et al., 2017), incluyendo el carácter R/S a CTS-Dpc (Chiesa et al., 2017). El umbral LOD empleado varió entre 3,0 y 0,15 (Choi et al., 2007).En esta población F2 caracterizada con 1135 MM de tipo SNP, 356 (31,37%) resultaron polimórficos. De éstos, 112 segregaron con una proporción 1:2:1 (9,87%), de los cuales se pudieron mapear 60 (5,29%) usando el programa MapDisto, con un valor de LOD de 1,5. Dado que la F2 ya había sido caracterizada fenotípicamente para la resistencia a CTS-Dpc por prueba de progenie, se incluyó en la construcción del mapa marco al gen de resistencia reportado por Peruzzo et al. (2019) como Rdc1, pero no fue posible localizarlo en ninguno de los grupos de ligamiento. Esto puede explicarse posiblemente por el hecho de que el número de plantas caracterizadas fenotípica y molecularmente no fue coincidente, tal lo reportado por Polzin et al. (1994), por problemas en la calidad de extracción del ADN, fallas de la PCR, lecturas ambiguas de los perfiles moleculares, entre otras causas.Por lo tanto, se recurrió al mapeo manual, calculando cosegregación entre cada SNP mapeado y el carácter resistencia a CTS, con las alternativas fenotípicas planta R o planta S, a los fines de poder calcular luego la distancia por el método del producto-proporción (Pierce, 2016). Para este cálculo, la segregación de cada SNP se analizó de acuerdo al segundo principio de herencia mendeliana, asignando la alternativa dominante al padre R. De esta manera, se pudieron localizar dos regiones genómicas ligadas al carácter, una en el cromosoma 9, marcada por el SNP Chr09_431, al cual el gen Rdc1 se encuentra a una distancia de 17cM; y otra en el cromosoma 19, marcada por el SNP Chr19_398, para el que la distancia es de 21,5 cM. Si bien era esperable, dada la segregación mendeliana 1:2:1 detectada por la prueba de progenie por Peruzzo et al. (2019), encontrar una única región genómica asociada a la resistencia a CTS-Dpc en esta generación F2, en este primer trabajo exploratorio se detectaron dos marcadores que cosegregaron con el carácter fenotípico, pertenecientes a distintos grupos de ligamiento. Estos resultados evidencian que en esta primera aproximación se han identificado dos regiones genómicas candidatas a estar involucradas en la determinación genética de la resistencia a CTS, lo que indica que es necesario en el corto y mediano plazo continuar saturando con marcadores moleculares las zonas cromosómicas cercanas a los SNP Chr09_431 y Chr19_398, a fin de dilucidar inequívocamente la ubicación genómica de Rdc1.Como conclusión, en base a los marcadores evaluados, se pudo construir un mapa marco consistente en 17 grupos de ligamiento, que abarca 14 de los 20 cromosomas de soja y cubre 176,13cM. Por otro lado, se detectó cosegregación entre la resistencia a CTS-Dpc y los marcadores SNPs Chr09_431 y Chr19_398, localizados en el mapa marco construido, lo que constituye un avance clave para el mejoramiento genético ya que permite sumar certeza a la identificación de genotipos portadores de genes Rdc mediante selección asistida.