EXTRACCIÓN DE ADN DE SEMILLA ÚNICA Y ESTUDIO DE LA FRECUENCIA DE UNA TRIPLE MUTACIÓN EN EL GEN DE LA EPSPS DE A. hybridus MEDIANTE HRMA (High Resolution Melting Analysis)

LARRAN, ALVARO S; PERMINGEAT, HUGO; PALMIERI, VALERIA E; PEROTTI, VALERIA; MARTINATTO, ANDREA

Rosario

Congreso; XX CONGRESO Y XXXVIII REUNIÓN ANUAL DE LA SOCIEDAD DE BIOLOGÍA DE ROSARIO. "INTERACCIONES ENTRE LOS SERES VIVOS Y AGENTES/CONDICIONES PATOGÉNICAS; 2018

Amaranthus hybridus es actualmente la maleza de hoja ancha más problemática para los cultivos de verano de nuestro país. Nativa de Sudamérica, esta maleza ha evolucionado en la resistencia a herbicidas con 5 sitios de acción diferentes, habiéndose reportado la primera población resistente en 1996. Recientemente, nuestro grupo de trabajo ha caracterizado la resistencia múltiple a herbicidas inhibidores de la ALS y a glifosato en una población de A. hybridus de la localidad de Canals, encontrando un mecanismo novedoso de resistencia a glifosato: una triple mutación en el gen codificante de la enzima target del glifosato, la EPSPS (5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa). El objetivo del presente trabajo consistió en el desarrollo de una técnica novedosa que permitiera el cálculo de la frecuencia de aparición de este alelo mutante en poblaciones de A. hybridus resistentes a glifosato. Para ello, inicialmente se buscó desarrollar un protocolo para la extracción de ADN genómico que fuera simple, barato, rápido y factible de aplicar para un alto número de muestras. El método consistió en la extracción de ADN de semillas únicas, comenzando por una hidratación de las mismas en agua durante 16 hs y continuando con su disrupción y posterior extracción de los ácidos nucleicos a través de un protocolo corto con el buffer CTAB. Seguidamente, las muestras de ADN genómico fueron sometidas por duplicado a un ensayo HRMA (High Resolution Melting Analysis) en donde un fragmento del gen epsps fue amplificado con oligonucleótidos específicos para la especie mediante PCR en tiempo real (qPCR) con el fluróforo SYBR safe. Las curvas de melting correspondientes a cada muestra fueron analizadas utilizando el software Rotor-Gene Q Series 1.7, determinando las temperaturas de melting (Tm) de los picos de mayor intensidad. Dos Tm diferentes fueron previamente asociadas al alelo wild-type y al alelo portador de la triple mutación, ya que este último presenta 3 transversiones que generan una disminución de 1-1,2 ºC en la Tm del amplicón. Gracias a esta previa validación que realizamos, pudimos clasificar a cada muestra biológica como wild-type, homocigota u heterocigota para la triple mutación. Nuestros resultados indicaron que el protocolo de extracción de ADN de semilla única fue exitoso (84% de efectividad), presentando un rendimiento adecuado para la sensibilidad de la qPCR. De las 64 semillas estudiadas de la población, un 50% presentó un único pico correspondiente a la Tm de la triple mutación, un 40% presentó dobles picos y el 10% restante presentó un único pico a la Tm del alelo wild-type. Por un lado, la alta frecuencia de aparición del alelo con la triple mutación indica una preponderancia de este mecanismo target en la población en estudio, que podría eventualmente expandirse a otras poblaciones. Por el otro lado, el porcentaje de muestras sin la triple mutación aportaría una evidencia a favor de la presencia de otro mecanismo de resistencia, pudiendo el mismo estar asociado al sitio de acción (como una amplificación en el gen de la epsps) o tratarse de un mecanismo no target (no asociado al sitio de acción), ya que en los experimentos de curvas dosis-respuesta, la tasa de supervivencia frente a dosis 1X de glifosato fue del 100%. Como perspectiva, nos proponemos estudiar el aumento en el número de copias del gen epsps en aquellas muestras en donde la triple mutación está ausente, de manera de poder estimar la frecuencia de individuos portadores de mecanismos de resistencia no target (si los hubiera), para luego adentrarnos en el estudio de los mismos.