CONSTRUCCIÓN DE VECTORES DE EXPRESIÓN CON NUEVOS GENES SELECTORES PARA EVENTOS DE CO-TRANSFORMACIÓN EN TRIGO

HUGO PERMINGEAT; ALVARO LARRAN

Rosario

Congreso; XIX Congreso y XXXVII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2017

Sociedad de Biología de Rosario

El trigo (Triticum aestivum) es un cereal que constituye un pilar fundamental en la nutrición y seguridad alimentaria de la humanidad. Hasta el día de la fecha, las variedades de trigo mejoradas en rendimiento, calidad y tolerancia a condiciones de estrés han sido desarrolladas principalmente por mejoramiento genético clásico. Las nuevas tecnologías que utilizan herramientas como la transgénesis y la edición genética deben enfrentarse a una especie hexaploide, con un gran genoma y un alto número de secuencias repetidas de ADN. Si bien la biobalística y la transformación mediada por Agrobacterium ya han mostrado su potencial para desarrollar trigo transgénico, estas técnicas suponen la incorporación de genes marcadores que, si bien aumentan la eficiencia del proceso, pueden producir defectos indeseados en la variedad transformada y potenciales peligros medioambientales. El objetivo del presente trabajo consistió en la construcción de vectores de expresión que porten distintas versiones del gen als (acetolactato sintasa) para ser potencialmente utilizados como genes selectores en eventos de co-transformación de trigo, proveyendo de un amplio rango de compuestos químicos a utilizar en un único gen, y posibilitando su segregación y eliminación en posteriores generaciones. Para ello, tres versiones alélicas previamente clonadas en los vectores de expresión pGEM-T Easy y provenientes de poblaciones con resistencia cruzada a inhibidores ALS de A. palmeri, fueron subclonadas en el vector de expresión pMF6 (diseñado para monocotiledóneas). La estrategia de subclonado consistió en la digestión de ambos vectores con 1 unidad de las enzimas de restricción BamHI y KpnI durante 3 horas a 37 ºC en un medio con concentración 1X de buffer MultiCore, su posterior purificación en columna y su ligación con 0,5 unidades de la enzima T4 ADN ligasa a 4 ºC durante toda la noche. Paso siguiente, se realizó la transformación de células competentes de E. coli DH5α y los clones obtenidos fueron chequeados por PCR de colonia con oligonucleótidos que amplifican una región recombinante inserto-vector. Aquellos clones positivos, fueron crecidos en medios selectivos con el fin de realizar minipreparaciones plasmídicas. Paralelamente, se iniciaron cultivos in vitro de trigo de la variedad comercial Brujo, a partir de embriones inmaduros de 0,2-0,5 mm para la inducción de callos embriogénicos. Los mismos se cultivaron en oscuridad y, a partir de la segunda semana, se desarrollaron curvas de selección con 0, 1, 2 y 5 μM de imazetapir. Luego de 6 semanas, se evaluó el porcentaje de inducción y los callos fueron transferidos a un medio de regeneración de plantas por embriogénesis somática bajo los mismos tratamientos, evaluando los porcentajes de regeneración. Como resultado, pudimos construir 3 vectores de expresión con las variantes alélicas als wild-type (control), W574L (mutación que otorga resistencia cruzada) y A282D (mutación con potencial efecto de resistencia). A su vez, pudimos determinar que una concentración equivalente a 1 μM de imazetapir permitiría la selección de explantos expresando el gen de selección, ya que la misma produce una reducción drástica del porcentaje de regeneración de explantos (del 100% en los controles a un 3,33%), sin observarse diferencias significativas entre los porcentajes de inducción, que superan el 88% en todos los tratamientos (p>0,05). Estos resultados preliminares nos acercan a la posibilidad de efectuar experimentos de co-transformación en trigo utilizando genes selectores que implican el uso de herbicidas de bajo impacto ambiental, aunque aún resta la construcción de curvas de selección con otros principios activos para poder evaluar la posibilidad de utilizar un único gen en la rotación de agentes de selección.