Construcción de un replicon viral de Semliki Forest vírus y evaluación de la respuesta inmune humoral inducida en peces

THELMA VERONICA POGGIO

Buenoa Aires

Congreso; Congresos Sociedad Argentina Virologia; 2011

Sociedad Argentina de Virología

CONSTRUCCION DE UN REPLICON VIRAL DE SEMLIKI FOREST VIRUS Y EVALUACION DE LA RESPUESTA INMUNE HUMORAL INDUCIDA EN PECES Ogas ML1, Poggio TV1,Scodeller EA2, La Torre JL1, Grigera PR1. 1. Centro de Virología Animal-CEVAN-Centro de Ciencia y Tecnología Milstein-CONICET 2. Instituto de Medicina y Biología Experimental de Cuyo de (IMBECU)-CONICET,Mendoza. INTRODUCCIÓN La vacunación antiviral es clave en el control sanitario/epidemiológico de poblaciones humanas y animales. Algunas estrategias clásicas que utilizan virus inactivado o alternativas usando subunidades recombinantes no han sido efectivas para inducir protección contra virus de relevancia debido a la incapacidad del antígeno de mimetizar la estructura nativa de la proteína presente en el virión. Las vacunas genéticas basadas en replicones de alfavirus como Semliki Forest Virus (SFV) brindan la posibilidad de inducir respuesta inmune específica contra formas nativas de proteínas estructurales de virus, donde el gen del inmunógeno específico, bajo control de un promotor eucariota, sustituye a los genes correspondientes a las proteínas estructurales. Luego de la transfección, la síntesis de proteínas no estructurales y componentes de la replicasa viral, es inducida ?in vivo? formándose transcriptos del genoma viral híbrido que servirán de templado para la amplificación y la transcripción de un ARN codificante del inmunógeno elegido. OBJETIVO Construcción de un replicón de SFV capaz de expresar el antígeno modelo β-galactosidasa e inducir respuesta inmune específica en peces. METODOLOGÍA Construcción del replicón viral: Se introdujo el promotor de Citomegalovirus río arriba de la replicasa viral y bajo el promotor secundario viral, el gen reportero Lac Z (β-galactosidasa) mas una secuencia de poliadenilación eucariota. Evaluación de la funcionalidad del replicón: Se transfectaron células BHK, se practicaron tinciones con X-Gal en las células fijadas y se evidenció la actividad enzimática de β-galactosidasa y su caracterización inmunológica por Western blot. Evaluación de la inmunogenicidad del replicón: Se inocularon por vía intramuscular dos grupos de 25 truchas arcoíris (Oncorhynchus mykiss), un grupo recibió 100 µg de ADN correspondiente a los replicones virales codificantes para Lac Z, mientras que el grupo control recibió PBS. La detección de anticuerpos específicos contra β-galactosidasa se realizó por ELISA a día 0 y 45 post-vacunación. RESULTADOS Y CONCLUSIONES Los resultados demuestran la fidelidad de la secuencia del replicón construido y su funcionalidad en líneas celulares eucariotas que expresan una proteína de peso molecular esperado reconocida por el anticuerpo comercial anti- β-galactosidasa validándose la expresión rápida y eficiente del antígeno modelo. Los niveles de actividad enzimática frente al sustrato O-Nitrofenil 13-B-galactopiranósido fueron significativamente mayores a los detectados en los controles sin transfectar. Las tinciones de células fijadas que expresan el gen reportero demuestran la presencia del sustrato cromogénico X-GaL no detectable en los controles de transfección. Los títulos de anticuerpos anti- β-galactosidasa obtenidos en peces inoculados con el replicon son mayores a los obtenidos en los controles y esta diferencia es estadísticamente representativa. Por primera vez se ha demostrado la inducción de respuesta inmune específica del replicón en especies salmonídea lo cual señala a los vectores basados en el SFV como candidatos con gran potencial para la generación de vacunas genéticas aplicables a la salmonicultura.