Discrepancia en la tipificación de los antígenos D y E del Sistema Rh: importancia de utilizar 2 clones anti-D para evidenciarla

IÑIGUEZ E; LUJÁN BRAJOVICH M; LONGO E; TRUCCO BOGGIONE C; CARPENTI N; MATTALONI S; COTORRUELO C

Buenos Aires

Congreso; XV Congreso Argentino de Medicina Transfusional; 2015

Asociación Argentina de Hemoterapia e Inmunohematología

Fundamento: el Sistema Rh es el grupo sanguíneo más complejo y polimórfico de la membrana del glóbulo rojo. Se han descripto numerosas variantes alélicas de los genes RHD y RHCE que conducen a una expresión alterada de los antígenos Rh, principalmente D (Dvar), C (Cvar) y E (Evar). El estudio de la organización genética del locus RH permite desarrollar estrategias de genotipificación para predecir el fenotipo Rh cuando existe una expresión antigénica aberrante.Objetivos: el objetivo de este trabajo fue investigar las causas de una discrepancia en la tipificación del antígeno D y E del Sistema Rh en un grupo familiar.Materiales y Métodos: las muestras con expresión aberrante de los antígenos D y E estudiadas pertenecen a dos hermanos (H1 y H2) y a su padre (PP). También se estudió una muestra obtenida de la madre (MM). Se investigó el fenotipo D por hemaglutinación con 4 reactivos monoclonales anti-D: IgM/IgG (clones TH28 / MS26), IgM (clon MS201), IgM (clon RUM1) e IgM (clones LDM1 y ESD1M). También se estudió el fenotipo Rh completo con anticuerpos anti-C (clone MS24), anti-c (clone MS33), anti-E (clon MS258/MS80) y anti-e (clones MS16 + MS21 + MS63). Se obtuvo ADN genómico a través del método de salting-out. Se aplicaron técnicas de PCR-SSP para detectar alelos D débiles tipo 1, 2, 3 ó 4 y para escanear los 10 exones del gen RHD. Se secuenciaron por la técnica de Sanger cada uno de los 10 exones de ambos genes RH.Resultados: las reacciones de hemaglutinación de H1, H2 y PP con los diferentes reactivos anti-D fueron negativas excepto para el clon RUM1 que mostró una reacción débilmente positiva. La muestra MM resultó D positiva. El fenotipo Rh completo de H1 y H2 identificado fue Dvar,C-,c+,E+,e- mientras que para PP fue Dvar,C-,c+,E-,e+ y para MM fue D,C+,c+,E+,e+. Debido al aparente caso de exclusión de la paternidad se investigó el antígeno E en la muestra PP utilizando 2 reactivos monoclonales anti-E IgM (MS260 y MS80). Se observó aglutinación débil con el clon MS260 indicando que el fenotipo Rh de la muestra PP era Dvar,C-,c+,Evar,e+. Los estudios moleculares permitieron descartar los alelos D débil Tipo 1 al 4 y mostraron la presencia de los 10 exones del gen RHD. El análisis de la secuencia del gen RHD permitió identificar una mutación puntual 46T>C en el exón 1, responsable del cambio Trp16Arg. Por otro lado, en la muestra con expresión alterada del antígeno E (PP) se detectaron las mutaciones 697C>G, 712A>G, 733C>G y 744T>C en el exón 5 del alelo RHcE responsables de las sustituciones Gln233Glu, Met238Val y Leu245Val. La mutación hallada en la posición 744 no introdujo cambio de aminoácido. El estudio de segregación alélica en el grupo familiar permitió determinar que ambos alelos mutados se encontraban en posición cis. Conclusiones: la baja frecuencia poblacional de las variantes alélicas RHD y RHcE halladas en este estudio sugiere un desequilibrio de ligamiento entre las mismas. El cambio de aminoácidos hidrofóbicos (Trp) o polares (Gln) por residuos cargados (Arg, Glu) dificultaría el correcto ensamblaje de los polipéptidos Rh en la membrana del eritrocito provocando la expresión alterada del antígeno D y del antígeno E. Este estudio demuestra la importancia de utilizar clones diferentes de anti-D que posean un comportamiento de reacción distinto y complementario frente a las distintas variantes D. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que los estudios moleculares son un complemento necesario para la caracterización de muestras con fenotipo Rh variante. La combinación de las técnicas serológicas y moleculares para la determinación Rh en dadores y receptores constituyen una mejora de la eficacia y seguridad de la terapia transfusional.