Rol del receptor purinérgico P2X7 en la regulación de la proliferación y diferenciación celular en la retina del zebrafish adulto.

MEDRANO MATÍAS; FAILLACE, MARÍA PAULA

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A diferencia de los mamíferos, laretina de los peces teleósteos crece durante la vida adulta y se regenera luegode un daño. La regeneración se inicia cuando la glía de Müller recibe señalesdel microambiente dañado (factores de crecimiento, citocinas, nucleótidosextracelulares) que inducen su desdiferenciación parcial y reingreso al ciclocelular dando progenitores multipotentes capaces de diferenciarse en todos lostipos celulares retinianos.  Se demostróen el laboratorio que el sistema purinérgico, en particular el ADP extracelular(ADPe) a través del P2Y1R, incrementa el número de progenitores derivados de laglía de Müller y posiblemente participa de la inducción de la regeneración, apartir de la activación mitótica de una subpoblación de células de Müller.Asimismo, la señalización activada por el ADPe y el P2Y1R estimula la actividadproliferativa de precursores de fotorreceptores bastones en la capa nuclearexterna (ONL). Además, esta vía regula la proliferación del epitelio ciliar concélulas progenitoras multipotentes que se diferencian y promueven elcrecimiento tisular. Por otro lado, varios tipos de receptores purinérgicos,que unen nucleótidos y nucleósidos extracelulares, y las enzimas que loshidrolizan (E-NTPDasas) se distribuyen diferencialmente en las capasretinianas. De este modo, la activación prolongada del P2X7R potencia patologíasretinianas, donde ocurren incrementos muy significativos en la [ATPextracelular] ([ATPe]: 50-100mM). Este receptor, cuyo rol no ha sido elucidadoen la retina de zebrafish, provoca muerte celular por ingreso de Ca2+ yactivación de la microglía que libera más ATP y factores pro-inflamatorios(TNFα e IL-1β). En contraste, este receptor activado por concentracionesfisiológicas de ATPe (5-10μM), posee roles neuro-glio-protectores y media latransmisión sináptica entre neuronas y glia de Müller. Asimismo, el P2X7Rregula el flujo sanguíneo local, volumen celular y crecimiento axonal. En laretina de roedores, en diferentes modelos de injuria, aumenta la expresión delP2X7R.  Objetivo: nos propusimos estudiar elrol del P2X7R en modelos de lesión/regeneración y durante el crecimiento normalretiniano en el zebrafish adulto. Métodos:  Para examinar la participación del P2X7R en elcrecimiento celular, se trataron retinas sin lesionar de zebrafish conagonistas (ATPγS o BzATP) y/o un antagonista específico del P2X7R (A740003,25μM), mediante microinyecciones intraoculares (in vivo) de estoscompuestos.  Para estudiar el rol delP2X7R en la regeneración, se realizaron 2 tipos de injuria, en presencia oausencia de A740003 inyectado intraocularmente durante varios días:  1- Se lesionaron principalmente las capasinternas de la retina mediante la inyección de la toxina Ouabaína (8μM) queinhibe la actividad de la Na+/K+ ATPasa. Los peces fueron sacrificados a los 7días post lesión (dpl) durante el pico de proliferación.  2- Se optimizó un nuevo tipo de injuria ennuestro laboratorio, además del ya caracterizado modelo citotóxico conOuabaína, basado en la inyección de CoCl2, un inhibidor de la degradación delFactor Inducible por Hipoxia. El CoCl2 (1.5mM) causó principalmente muerte delos fotorreceptores. Los peces fueron sacrificados en el pico de proliferacióncelular a los 4 dpl, descripto en nuestro laboratorio.  Resultados: El tratamiento intraoculartanto de ATPɣS (800μM) como de BzATP (800μM) indujo aumentos significativos enla proliferación de células progenitoras retinianas, a los 4 días postinyección, respecto a los ojos inyectados con vehículo. El ATPɣS indujo unincremento exclusivamente del número de precursores de los bastones, sinprovocar daño, ya que no se observaron cambios apreciables en la activaciónglial o la arquitectura retiniana. Este efecto no fue bloqueado por elantagonista A740003.  El BzATP, por otrolado, estimuló regeneración celular caracterizada por la presencia de clustersde células mitóticamente activas en la capa nuclear interna (INL) y unaumento de la expresión de GFAP en la glía de Müller. Además, se detectóapoptosis en la ONL, con un anticuerpo anti- Caspasa 3 activada. Todos estosefectos fueron inhibidos completamente por la co-inyección de A740003.  Resultados preliminares sugieren que elreceptor P2X7R participa diferencialmente en los dos modelos de lesión. Enlesiones con Ouabaína, la presencia de A740003 potenció el daño, denotado poruna morfología retiniana desordenada y un aumento significativo en el número decélulas proliferativas (clusters en la INL). Por otro lado, en retinastratadas con CoCl2 y el antagonista del P2X7R, se observó una mejorconservación tisular y una menor cantidad de células proliferativas. Además,los niveles de ARNm del P2X7R, determinados por PCR  cuantitativa, aumentaron significativamente eneste modelo de lesión. No se observaron diferencias significativas en la lesióncon Ouabaína. Conclusiones: Estos resultados sugieren laparticipación del P2X7R en la inducción de la injuria, principalmente en lascapas externas, y la consecuente activación glial e inducción proliferativa deprogenitores retinianos. En contraste, el ATPɣS indujo un incremento deprecursores proliferativos en la ONL, que podría deberse a la activación deotro receptor purinérgico como el P2Y1R, estimulando la generación de bastonesdurante el crecimiento de la retina.  Losresultados en conjunto sugieren mecanismos de regulación dual del P2X7R enambos modelos de lesión. En este sentido, la activación prolongada del P2X7Rpor BzATP o la lesión de los fotorreceptores y células del EpitelioPigmentario, que liberan al medio extracelular concentraciones milimolares deATP, provocaría un incremento de la expresión de las subunidades del P2X7Rademás de una sobre-activación prolongada, induciendo la formación de homómerosdel P2X7R con un poro que permite un ingreso masivo de Ca2+ induciendoapoptosis. Por otro lado, la lesión con ouabaína no provoca aumentos en laexpresión del P2X7R y posiblemente, la liberación de ATP al medio extracelularsería menor, debido al reducido número de células en las capas más internas(ganglionares y amácrinas) y no induciría la formación de grandes poros en elP2X7R. Por consiguiente, la activación de este receptor por concentracionesextracelulares de ATP no tan elevadas, causaría neuroprotección o inhibición dela proliferación en las capas internas (glia de Müller, endotelio, microglía).  Estos modelos permiten analizar con detalle elrol de los diferentes componentes del sistema purinérgico en procesospatológicos que afectan a los fotorreceptores o principalmente, a las capasinternas y células ganglionares.