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Laboratorio de Biomembranas, IFIBIO Houssay (UBA-CONICET)La entrada de Ca2+ desde elmedio extracelular es esencial para la activación de diversas funcionescelulares. SOCE (delinglés ?Store Operated Calcium Entry?)es un importante mecanismo para el ingreso de Ca2+ regulado por elnivel de Ca2+ en los depósitos intracelulares. Los recientesdescubrimientos en relación con SOCE han abierto nuevos caminos en lainvestigación de cómo este catión dirige el destino celular. La entradaselectiva de Ca2+ está mediada por la interacción de dos moléculasSTIM1 y ORAI1. STIM1 es un sensor de Ca2+ en el retículoendoplasmático y ORAI1 es un canal en la membrana por el cual ingresa Ca2+para rellenar los depósitos. También se han descripto a TRPC1 como componenteclave en la entrada de Ca2+. El rol de otros TRPs como el canal deCa2+ TRPV4 (Transient Receptor Potential Vanilloid 4) en SOCE es aúncontrovertido (Ma y col., 2011; Loreanzo y col., 2008). Recientemente se hadescripto que existe un complejo TRPV4-STIM1 que modifica la localización deTRPV4 en membrana (Shin y col., 2015).Un trabajo previo de nuestro laboratorio demostró que, en células renales, laactivación y localización del TRPV4 es modulada por el canal de agua AQP2(Acuaporina 2) en condiciones de hipotonía. Este mecanismo juega un rolfundamental en la regulación del volumen celular (Galizia y col., 2012). Otros autores encontraron que TRPV4 interacciona con AQP4 y AQP5modulando el volumen celular en distintos sistemas (Liu ycol., 2006; Benfenati y col., 2011, Jo ycol. 2015). Elobjetivo del presente trabajo fueestudiar, en células renales, las consecuencias de la interacción TRPV4-AQP2sobre SOCE en condiciones de isoosmolaridad. Utilizamos como modelo dos líneas celularesque derivan de túbulo colector de rata; unaque no expresa AQP2 (WT-RCCD1) y otra, transfectada en forma establecon cDNA de AQP2 (AQP2-RCCD1) (Capurroy col 2001, Ford y col. 2005). Utilizando un protocolo clásico para cuantificar SOCE evaluamos mediante la técnica de microscopía de fluorescencia loscambios en los niveles intracelulares de Ca2+ [Ca2+]iy en el potencial de membrana (Vm) utilizando FURA2-AM y DIBAC4(3)respectivamente. Encontramosque, al activar el TRPV4 con un activador específico (4α-PDD, 10 µM) SOCE fue mayoren las células que expresan AQP2 respecto de las WT (Figuras A y B). Laincubación con un inhibidor de SOCE (SKF-96365, 20 µM) anuló las diferenciasencontradas al activar TRPV4 (Figura C). Dado que SOCE es un mecanismoaltamente sensible a alteraciones del Vm (Bird ycol., 2008) estudiamos siactivar TRPV4 durante SOCE modificaba el Vm. Encontramos que lasdiferencias observadas en SOCE correlacionan con cambios opuestos en el Vm al activarel TRPV4. Las células que expresan AQP2 se hiperpolarizan y las células WT se despolarizan(Figura D). Seha descripto que la entrada de Ca2+ a través de TRPV4, puede activar canales de K+sensibles a Ca2+ (KCa). La activación de TRPV4 entonces, puede producir una hiperpolarización (Arnhold y col., 2007; Sonkusare y col.,2012; Berrout y col., 2014) o unadespolarización (Konno y col., 2012)en función de diferencias en la expresión de canales TRPV4 y KCa. Recientementese ha descripto en túbulo colector de ratón, que la activaciónde TRPV4 gatilla canales SK3 (unsubtipo de KCa) produciendo una hiperpolarización del Vm (Berrout y col 2014). Teniendo en cuentaestos hallazgos, probamos el efecto de laapamina (300 nM), un inhibidor de canales SK, sobre la potenciación de SOCE porTRPV4 en células que expresan AQP2. La figura E muestra que la apamina disminuye el aumento de SOCE observado en lascélulas AQP2-RCCD1 y no tuvo consecuencias sobre SOCE en ausencia de activación de TRPV4. Nuestros resultados sugieren queTRPV4 activa canales SK3 generando una hiperpolarización del Vm, que a su vezpotencia a SOCE en forma AQP2 dependiente. Por otra parte, experimentos diseñados para evaluar la acción de la fuerzaimpulsora sobre SOCE mostraron que ante una despolarización (generada por unaumento del K+ extracelular) los niveles de [Ca2+]i disminuyen encélulas WT en forma significativamente mayor que en células que expresan AQP2 (pendientes: WTHK=-0,021 ± 0,001 s-1vs. AQP2HK=-0,003±0,001 s-1; p<0,01 n=70) (FiguraF y G). Por el contrario, cuando solo se modificó el gradiente químicolas respuestas de células WT-RCCD1 y AQP2-RCCD1 fueron similares (pendientes:WTLCa = -0.016±0.001 s-1 vs. AQP2LCa = -0.015± 0.001 s-1; NS n=70). Estos resultados evidenciaron que la modulación de TRPV4 sobre SOCE en célulasAQP2-RCCD1 no se debe a una mayor sensibilidadde estas frente a cambios en el Vm. Por otra parte, experimentos de inmunofluorescenciamostraron que la tapsigargina (droga utilizada para gatillar SOCE) induce unaumento de los niveles de TRPV4 en la membrana plasmática sólo en las célulasque expresan AQP2 (Figura H). Este resultado se basa enexperimentos donde cuantificamos los niveles colocalización de TRPV4 con la membrana(marcada con Wga-488) mediante el coeficiente de Pearson en células WT-RCCD1 y AQP2-RCCD1 pretratadasdurante 10 minutos, con tapsigargina o vehículo (DMSO). Los únicos valoressignificativamente distintos de cero fueron los de las células AQP2-RCCD1 tratadas contapsigargina (0,15 ± 0,04; n=12). Conjuntamente losresultados del presente trabajo muestran nuevos roles para AQP2 que sonindependientes de alteraciones de la osmolaridad del medio extracelular.Demostramos por primera vez, en células renales que los cambios en Vm asociadosa la activación TRPV4 dependen de la expresión de AQP2. En particular, laexpresión de AQP2 facilita la activación del canal SK que conduce a unahiperpolarización de la membrana celular, impactando en SOCE. Además la modulación de SOCE por AQP2 implicatranslocación de TRPV4 a la membrana confiriendo una respuesta distinta acambios del gradiente eléctrico.