Desarrollo nacional de un Kit de ELISA para la detección de anticuerpos anti-transglutaminasa en pacientes con enfermedad celíaca

ZUNINO SEBASTIÁN; DE MARZI MAURICIO C; CERNY NATASHA; BELFORTE FIORELLA; IACONO RUBÉN; TAMBORENEA, MARÍA INÉS; MALCHIODI EMILIO L.

Buenos Aires

Simposio; Simposio Panamericano de Enfermedad Celíaca; 2018

Asociación para el Estudio de las Enfermedades del Intestino (AEDEI)

Introducción: Dada la variedad de síntomas asociados a Celiaquía se hace dificultoso el diagnóstico preciso de la EnfermedadCelíaca (EC). Para ello se dispone de procedimientos basados en la detección serológica de anticuerpos que junto a estudiosgenéticos permiten detectar pacientes de riesgo que requerirán estudios confirmatorios de biopsia intestinal. Los anticuerposanti- transglutaminasa (aTg), isotipo IgA, representan una herramienta de utilidad tanto para el diagnóstico como elseguimiento de estos pacientes. El screening retrospectivo de este marcador inmunológico es de importancia para establecerla incidencia poblacional de esta patología autoinmune. Dado que la detección de aTg se realiza empleando kits importadosde alto costo, nos planteamos como objetivoObjetivos: desarrollar un kit nacional de bajo costo para la detección de Ac aTg, isotipo IgA, que posibilite un estudioretrospectivo del marcador aTg en la población en estudioMateriales y Métodos: Se clonó y expresó la proteína recombinante Transglutaminasa tisular tipo 2 (r-tTg-2), se purificócon sistemas de afinidad empleando un Tag de 6 histidinas (His6) incorporada a la secuencia. La xpresión y purificación fuémonitoreada por SDS-PAGE y Western blot empleando un anticuerpos específico. La inmovilización de la r-tTg-2 en las placasde ELISA se optimizó evaluando tiempos y concentraciones de pegado. La inmunoreactividad de la proteína fue evaluadaempleando sueros de referencia. Con el objeto de evaluar la performance analítica se procesaron 350 muestras de voluntariosobtenidas en convocatorias realizadas en la localidad de Chivilcoy, empleando nuestro método en paralelo con el métodocomercial (Orgentec). Todos los datos e información clínica de cada voluntario fueron cargados y almacenados en un softwarediseñado para este fin. La evaluación estadística de los resultados consistió en calcular el cut-off, expresado como la media+3SD. Las comparaciones de los resultados obtenidos por los distintos métodos se realizaron por medio de curvas ROC.Resultados: Se clonó y expresó la rTg de 699 aa, ON a 20°C. Se purificó con concentraciones crecientes de imidazol,obteniendo una proteína pura de 79 kDa, dializada y conservada a -20°C. Se optimizó el pegado de la rTg (5ug/ml por well),los tiempos de incubación (1 h a 37°C), y la dilución sérica (1ul/100ul). Obteniendo el valor de 80 muestras en simultáneo.El valor de corte del método fue establecido procesando 200 muestras de individuos negativos para EC y sin otra patologíaautoinmune. Se obtuvo un valor de sensibilidad de 0.727% y especificidad de 0.944%. El enzimoinmunoenzayo (ELISA)desarrollado para la detección de anticuerpos antiTg, fue denominado CELISAR (CElíacos-ELISA-ARgentino). .Conclusiones: Se logró la puesta a punto de un kit nacional para la determinación de aTg IgA, importante en el diagnósticoy seguimiento de EC. La implementación de CELISAR, de menor costo que los importados, permitirá que un mayor númerode pacientes accedan al diagnóstico y obtener así, a partir de estudios epidemiológicos, datos certeros de referencia en elpaís.