DESARROLLO NACIONAL DE UN KIT DE ELISA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI- TRANSGLUTAMINASA EN PACIENTES CON ENFERMEDAD CELÍACA

CERNY NATASHA; ZUNINO SEBASTIÁN; DE MARZI MAURICIO C; TAMBORENEA, MARÍA INÉS; MALCHIODI EMILIO L.; TOLOSA GABRIEL; BELFORTE FIORELLA; IACONO RUBÉN

Luján

Jornada; I Jornadas de Ciencia, Tecnología y Extensión UNLu; 2018

Universidad Nacional de Luján

IntroducciónDada la variedad de síntomas asociados con la enfermedad celíaca (EC) se hace dificultoso obtener un diagnóstico preciso de la enfermedad. Para ello se dispone de procedimientos basados en la detección serológica de anticuerpos específicos que junto a estudios genéticos permiten detectar pacientes de riesgo que requerirán estudios de biopsia intestinal confirmatoria de biopsia intestinal. Los anticuerpos (Acs) anti- transglutaminasa (aTg), isotipo IgA, representan una herramienta de gran utilidad tanto para el diagnóstico como el seguimiento de estos pacientes. El screening retrospectivo de este marcador inmunológico es de importancia para establecer la incidencia poblacional de esta patología autoinmune. ObjetivosDado que la detección de aTg se realiza empleando kits importados de alto costo, nos planteamos reemplazar las importaciones y ampliar los datos sobre la prevalencia de EC en Argentina. Para ello nos propusimos desarrollar un kit nacional de bajo costo para la detección de Acs aTg, isotipo IgA, que posibilite un estudio retrospectivo del marcador aTg en la población en estudio. MetodologíaSe clonó y expresó la proteína recombinante Transglutaminasa tisular tipo 2 (r-tTg-2), se purificó con sistemas de afinidad empleando un Tag de 6 histidinas (His6) incorporada a la secuencia. La expresión y purificación fué monitoreada por SDS-PAGE y Western blot empleando un anticuerpo específico. La inmovilización de la r-tTg-2 en las placas de ELISA se optimizó evaluando tiempos y concentraciones de pegado. La inmunoreactividad de la proteína fue evaluada empleando sueros de referencia.Con el objeto de evaluar la performance analítica se procesaron 350 muestras de voluntarios obtenidas en convocatorias realizadas en la localidad de Chivilcoy, empleando nuestro método en paralelo con el método comercial (Orgentec). Todos los datos e información clínica de cada voluntario fueron cargados y almacenados en un software diseñado para este fin.La evaluación estadística de los resultados consistió en calcular el cut-off, expresado como la media +3SD. Las comparaciones de los resultados obtenidos por los distintos métodos se realizaron por medio de curvas ROC.ResultadosSe clonó y expresó la rTg de 699 aa, ON a 20°C. Se purificó con concentraciones crecientes de imidazol, obteniendo una proteína pura de 79 kDa, dializada y conservada a -20°C.Se optimizó el pegado de la rTg (5ug/ml por well), los tiempos de incubación (1 h a 37°C), y la dilución sérica (1ul/100ul). Obteniendo el valor de 80 muestras en simultáneo.El valor de corte del método fue establecido procesando 200 muestras de individuos negativos para EC y sin otra patología autoinmune. Se obtuvo un valor de sensibilidad de 0.727% y especificidad de 0.944%.El enzimoinmunoenzayo (ELISA) desarrollado para la detección de anticuerpos anti-Tg, fue denominado CELISAR (CElíacos-ELISA-ARgentino).ConclusionesSe logró la puesta a punto de un kit nacional para la determinación de aTg IgA, importante en el diagnóstico y seguimiento de EC. Contar con un gran número de muestras de voluntarios nos permitió comparar la performance analítica de CELISAR frente a los ELISAs comerciales empleados. La implementación de CELISAR, de menor costo que los importados, permitirá que un mayor número de pacientes accedan al diagnóstico y obtener así, a partir de estudios epidemiológicos, datos certeros de referencia en el país.