Precipitación de Tripsina con un copolímero sintético biodegradable derivado de la Timina

P. ANSELMI; E. MARIÑO; M. BRAIA; D.M. MARTINO; D. ROMANINI

Zavalla, Santa Fe

Congreso; XV Congreso y XXXIII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2013

SBR

El desarrollo de nuevos polímeros sintéticos biodegradables ha impulsado una amplia variedad de aplicaciones en el campo de la tecnología. Una de estas aplicaciones es la capacidad de formar complejos insolubles con proteínas de carga opuesta y dicha característica puede ser explotada como método de separación o inmovilización de enzimas a escala industrial. El copolímero biodegradable de vinilbencil timina (VBT) y vinilfenil sulfonato (VPS) es soluble en agua, ambientalmente benigno y posee una alta densidad de carga negativa en un amplio rango de pH, debido a la presencia de grupos sulfónicos en la subunidad VPS. En este trabajo nos hemos propuesto evaluar la capacidad del copolímero VBT:VPS (1:1) de formar complejos insolubles con tripsina (TRP) como punto de partida de una estrategia que pueda aplicarse a la bioseparación y la inmovilización de esta enzima. Para ello, se aplicaron técnicas de turbidimetría y medidas de actividad enzimática para evaluar la formación del complejo insoluble y la estabilidad de la tripsina en presencia del polímero. La información recopilada permitió diagramar un método de precipitación de TRP por formación del complejo insoluble con VBT:VPS. Se prepararon tres sistemas con TRP y polímero a tres relaciones molares diferentes que aseguren la formación del complejo insoluble, y se centrifugaron 10 minutos a 2000 rpm. El precipitado formado se separó del sobrenadante y se redisolvió al mismo volumen inicial con buffer TRIS/citrato 50 mM/50mM pH 8,2. Finalmente, se midió actividad enzimática a una solución control de TRP a pH de máxima actividad y a cada una de las fracciones obtenidas en la precipitación. La actividad de TRP se determinó espectrofotométricamente a 400 nm midiendo el incremento de absorbancia durante 5 minutos a intervalos de 30 segundos. Se calculó el porcentaje de TRP precipitado por el polímetro VBT:VPS como la relación entre la actividad del precipitado redisuelto y del control. Los resultados obtenidos mostraron que la TRP presenta una alta tendencia a la precipitación por formación de complejos insolubles con el VBT:VPS a pH 3,0 y que el complejo que forman se solubiliza a pH 8,2. La velocidad de formación del complejo insoluble fue prácticamente instantánea al adicionar el polímero a la solución de enzima.  También se observó que la actividad enzimática no se vio afectada significativamente por la presencia del polímero en el rango de concentraciones de trabajo. Finalmente, aplicando el método de precipitación se obtuvo un 75,36 % de la actividad enzimática en el precipitado. Estos resultados preliminares hacen presuponer que esta metodología posee un alto potencial de aplicación para la obtención, concentración  e inmovilización de la TRP.