Supervivencia frente condiciones gastrointestinales simuladas de Lactobacillus salivarius DSPV 010P encapsuladas destinadas a pollos parrilleros

SIRINI, N.E.; MARTÍ, L.E.; WERNING, L.; SIGNORINI, M. L.; BERISVIL, A.P.; ZBRUN, M.V.; SOTO, L.P.

Esperanza

Jornada; VIII Jornada de Difusión de la Investigación y extensión. FCV-UNL; 2020

Facultad de Ciencias Veterinarias. UNL

El uso de los probióticos como herramienta profiláctica en sistemas de crianza intensiva de pollos parrilleros, está cobrando mayor relevancia en las últimas décadas. Éstos son microorganismos vivos que administrados en cantidades adecuadas confieren efectos benéficos en el hospedador1 . Los probióticos deben sobrevivir a diversos factores como el proceso de producción, las condiciones de almacenamiento y las bio-barreras del hospedador hasta llegar al intestino del mismo. Para mejorar la tasa de supervivencia de los microorganismos probióticos frente a estos factores, se pueden aplicar diversas técnicas de conservación tales como la liofilización y la encapsulación. La encapsulación se considera una metodología prometedora para la protección de las bacterias ya que protege a las bacterias de las condiciones adversas del medio ambientes. Para que ejerzan su efecto beneficioso, los probióticos deben estar presentes a un nivel mínimo (NMS) de 6 o 7 log UFC/g en el alimento a consumir o una ingesta diaria mínima de 8 log UFC2 . El objetivo de este estudio fue evaluar la tasa de supervivencia de Lactobacillus salivarius DSPV 010P bajo diferentes formas de conservación, en condiciones gastrointestinales simuladas. La cepa estudiada fue L. salivarius DSPV 010P, de origen aviar. La cepa fue activada en placa con medio MRS (Man Rogosa Sharpe), a 37ºC por 72 hs en anaerobiosis. Luego se realizaron dos cultivos consecutivos en caldo MRS a 37ºC durante 18 hs. Posteriormente fue cultivada en un medio líquido desarrollado en el ?Laboratorio de Análisis de Alimentos del Instituto de Ciencias Veterinarias del Litoral (ICiVet UNL-CONICET)?, el cual contenía: permeado de suero de queso (60 g/l), extracto de levadura 4 (g/l), MnSO4 (0,003 g/l) y tween 80 (1 g/l). Con la biomasa obtenida se formularon, por un lado, cápsulas de almidón pregelificado y permeado de suero, en una concentración de 11 log UFC/g y por el otro, un liófilo en una concentración de 10 Log UFC/g. Tanto las cápsulas como el liófilo fueron conservados en frezzer -20 ºC hasta su utilización. Además se utilizó un cultivo de células libre. Para obtenerlo la cepa fue activada en placa con medio MRS y luego se realizaron dos cultivos consecutivos en caldo MRS a 37ºC durante 18 hs. La solución de jugo gástrica simulada (JGS) se preparó mediante la suspensión de pepsina (Riedel-de Haen, Seelze, Alemania) en una solución estéril de PBS a una concentración final de 3 g/l y ajustando el pH a 3,0 ± 0,2 con HCl (Cicarelli, San Lorenzo - Santa Fe ? Argentina) y NaOH estéril (Cicarelli, San Lorenzo - Santa Fe ? Argentina). La solución de jugo intestinal simulado (JIS) se preparó mediante la suspensión de tripsina (Gibco®-Thermo Fisher Scientific-Waltham, Massachusetts, Estados Unidos) y sales biliares (Britania, Buenos Aires, Argentina), en solución estéril de PBS a una concentración final de 1 g/l y de 1,8 g/l, respectivamente, ajustando el pH a 7,4 ± 0,2 con NaOH estéril (Cicarelli, San Lorenzo - Santa Fe ? Argentina). Ambas soluciones fueron filtradas para la esterilización a través de una membrana de 0,22 µm3 .Para llevar a cabo la digestión in vitro, un g de cápsulas, 1 g del polvo de las bacterias liofilizadas y 1 ml de células libres fueron incubadas en tubos falcon de 9 ml de JGS (pH = 3 ± 0,2) a 37ºC en agitación continua durante 2 hs para simular peristalsis (Shaker Mini Rocker MR-1, Boeco, Alemania). La supervivencia se evaluó en términos de recuento de colonias viables a tiempo 0 y después de la incubación a 37 ° C durante 2 hs. Luego, las células se recogieron y se suspendieron en JIS (pH 8) que contenía 1 mg / ml de pancreatina y 7 ml v/v de bilis. La suspensión se incubó a 37°C durante 4 hs. La viabilidad bacteriana fue evaluada al inicio del experimento y a las 4 hs de estar en el JIS, mediante recuento en placa. Se realizaron diluciones decimales seriadas en Ringer 1/4 (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido). Posteriormente, se sembraron en placas con agar MRS (Biokar, Beauvais, Francia) y se incubaron a 37ºC por 72 hs en anaerobiosis. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado. La diferencia en la pérdida de viabilidad bacteriana entre las cápsulas, el liófilo y el cultivo libre se analizó utilizando un ANOVA para medidas repetidas. Para las comparaciones entre grupos en un momento específico del ensayo se utilizó ANOVA de una vía. Además, se realizó un ANOVA de una vía con test de Duncan (tomando P< 0,05 como diferencia significativa) para evaluar diferencias entre los tiempo en un mismo grupo. La pérdida de viabilidad de L. salivarius DSPV 010P fue menor en las cápsulas, que en el liófilo y el cultivo libre a lo largo de todo el ensayo (P< 0,001). En el tiempo 0, los recuentos fueron de 11,21±0,05 Log UFC/ml para las cápsulas, de 10,61±0,05 para el liofilizado y 9,18±0,08 Log UFC/ml para el cultivo libre. Luego de 2 hs de incubación en JGS, las cápsulas tuvieron una pérdida de 0,14±0,01 Log UFC/ml, el liofilizado de 0,25±0,01 Log UFC/ml y el cultivo libre 0,35±0,12 Log UFC/ml con porcentaje de supervivencia del 71,3%, 54% y 45,3% respectivamente. Finalmente, luego de 4 hs de incubación en JIS, la pérdida de viabilidad total de las cápsulas fue de 0,58±0,09 Log UFC/ml frente a 1,03±0,05 del liofilizado y 1,56±0,16 Log UFC/ml del cultivo libre. El porcentaje de supervivencia de los microorganismos encapsulados fue del 44%, del liofilizado del 26,53% y del cultivo libre fue del 2,85%. El presente estudio ha demostrado que la encapsulación de probióticos en una matriz almidón pre-gelificado y permeado de suero mejoran significativamente la supervivencia en medio gastrointestinal simulada. Estas cápsulas permitirán a los microorganismos llegar viables a su sitio de acción y ejercer un efecto beneficioso para el animal.Bibliografía 1-FAO/WHO, (2001). Health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation. Food and agriculture organization of the United Nations and World Health Organization. Córdoba, Argentina. 2-2- Lian, W. C., Hsiao, H. C., & Chou, C. C. (2003). Viability of microencapsulated bifidobacteria in simulated gastric juice and bile solution. International Journal of Food Microbiology, 86(3), 293-301. 3-3- Musikasang, H., Tani, A., H-kittikun, A., & Maneerat, S. (2009). Probiotic potential of lactic acid bacteria isolated from chicken gastrointestinal digestive tract. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 25(8), 1337?1345.