CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO MASLÍNICO EN HÍGADOS DE RATAS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE EN TANDEM CON IONIZACIÓN POR ELECTROSPRAY Y DETECCIÓN POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS/MASAS (LC ESI MS/MS)

ZAYAS M; REBELINDO E; ORTEGA HH; BARCAROLO D; HUBER E; NEME L; ADDONA S; ANGELI E; SALINAS F; HEIN GJ

Jornada; VII Jornada de Difusión de la Investigación y Extensión; 2019

FCV-UNL

El ácido maslínico (ácido [2α,3β]-2,3-dihidroxiolean-12-en-28-oico) es un triterpeno pentacíclico que se encuentra presente en varias fuentes naturales, como por ejemplo en las hojas y cera de la piel de aceitunas. Estudios recientes han demostrado numerosas actividades biológicas de este compuesto que resultan beneficiosas para la salud de seres humanos y de animales. Entre sus aplicaciones, se utiliza en producción animal como aditivo alimentario para estimular el crecimiento.El objetivo de este trabajo fue desarrollar una metodología analítica para identificar y cuantificar ácido maslínico en hígados de ratas por cromatografía líquida de alta performance en tandem con ionización por electrospray y detección por espectrometría de masas/masas (LC ESI MS/MS).Se utilizaron 80 ratas divididas en dos grupos: Grupo experimental (20 machos y 20 hembras; dosis de ácido maslínico 1000 mg/kg/día) y Grupo control (20 machos y 20 hembras; sin sustancia de ensayo). La dosis de ácido maslínico fue administrada por vía oral a través del alimento balanceado. Los animales tuvieron libre acceso al alimento durante todo el estudio. Finalmente, las ratas fueron sacrificadas a los 7, 28, 56 y 91 días, con una tolerancia de ± 10%. Para la identificación y cuantificación del analito se utilizaron: un cromatógrafo líquido (UFLC) Shimadzu compuesto por 2 bombas modelo LC-20AD XR, desgasificador modelo DGU-20A3, inyector automático modelo SIL-20AC XR con horno calefactor de columna, y un espectrómetro de masas AB SCIEX modelo 3200 QTRAP triple cuadrupolo (MS/MS) hibrido con trampa de iones lineal con interfaz de ionización por electrospray (ESI). Los reactivos empleados (acetonitrilo, agua, metanol, formiato de amonio, hidróxido de amonio y acetato de etilo) fueron de grado analítico. Se optimizaron las condiciones operativas del espectrómetro para determinar el compuesto de interés y su estándar interno (ácido betulínico). Brevemente, la preparación de muestras consistió en el pesaje de 0,2 g de tejido en tubos eppendorf de 2 mL de capacidad y la adición de 100 µL de agua grado analítico. Se fortificaron las muestras con el estándar interno hasta una concentración nominal de 40 ppm y luego se agregó 1400 µL de acetato de etilo frío. Se vorterearon y sonicaron durante 15 min, se centrifugaron a 3500 g y 4°C durante 15 min y se trasvasaron los extractos resultantes a tubos de vidrio KHAN (5 mL). Se repitió la operación con los residuos de muestras para obtener un segundo extracto que se combinó con el primero; se evaporaron los extractos resultantes hasta sequedad bajo corriente de nitrógeno (10 psi) y en un baño con agua a 45ºC durante 20 min y se reconstituyeron los extractos secos con 200 µL de fase móvil, sonicándose durante 15 min. Finalmente se filtraron los extractos reconstituidos y se dispusieron en los correspondientes viales para su inyección en el cromatógrafo.La calibración se llevó a cabo en una matriz testigo de hígados de ratas, para el siguiente rango analítico nominal: 0,25, 0,5, 1, 2 y 4 mg/kg. Se calcularon los límites de detección (LD) y de cuantificación (LQ) para el compuesto de interés en hígados de ratas, siendo 0,20 mg/kg y 0,60 mg/kg, respectivamente. El estudio de recuperación se realizó en los niveles bajo, medio y alto del rango analítico, obteniéndose valores porcentuales de: 115, 98 y 89, respectivamente. Se desarrolló una metodología analítica para identificar y cuantificar ácido maslínico en hígados de ratas por LC ESI MS/MS, obteniéndose información valiosa y complementaria al protocolo diseñado para el estudio de ácido maslínico propuesto en el CMC. Resulta importante destacar que con los resultados obtenidos se pudo aportar información sobre la acumulación y metabolización del ácido maslínico en hígado, permitiendo a la empresa contratante avanzar con el registro de un suplemento nutricional en SENASA.