Influencia del estrés en la reproducción: participación del receptor de melanocortina tipo 2 en la respuesta ovárica bovina a la hormona adrenocorticotrópica.

BELOTTI, E.M.; AMWEG, AN; ETCHEVERS, L; RODRIGUEZ, FM.; CHIARAVIGLIO, GG; CATTANEO, ML

Jornada; VII Jornada de Difusión de la Investigación y Extensión de la Facultad de Ciencias Veterinarias, UNL; 2019

La ocurrencia de la primera ovulación y la lisis del primer cuerpo lúteo posparto son determinantes importantes para la eficiencia reproductiva de las vacas lecheras. La enfermedad quística ovárica es una importante disfunción ovárica y una de las mayores causas de subfertilidad en vacas lecheras de alta producción. Esta enfermedad afecta hasta un 15% de las vacas en el período posparto, momento crítico donde existe una transición desde una condición reproductiva no cíclica (preñez) al establecimiento de la ciclicidad regular; y ocasiona grandes pérdidas económicas. Aunque el mecanismo subyacente que conduce a la falla de la ovulación, la persistencia folicular y la formación de los quistes no se encuentra totalmente dilucidado, se ha propuesto que una alteración en la secreción de la hormona adrenocorticotrópica (ACTH) inducida por el estrés, podría causar estas alteraciones ováricas2. A diferencia de los esteroides sexuales y los glucocorticoides, la ACTH ha recibido poca atención como moduladora de las funciones reproductivas. En este sentido, nuestro grupo de trabajo ha demostrado previamente la presencia de los receptores de melanocortinas (MCRs) en el ovario bovino, sugiriendo un rol importante de esta hormona como moduladora de la función gonadal a través de los MCRs. Es por esto que planteamos como objetivo de este trabajo evaluar en un modelo experimental de estrés in vivo el efecto de la ACTH sobre el folículo preovulatorio mediante el análisis de la expresión del receptor de melanocortinas 2 (MC2R) y de su proteína accesoria (MRAP).Se utilizó un modelo experimental in vivo de inducción de estrés mediante la administración de ACTH. Para esto, en primer lugar, se utilizó un protocolo de sincronización de celo G6G-Ovsynch. A continuación, los animales se dividieron aleatoriamente en dos grupos: Grupo tratado: los animales recibieron 100 UI de ACTH (ELEA, Buenos Aires) cada 12 horas hasta el día esperado de la ovulación. Grupo control: los animales recibieron inyecciones de solución fisiológica cada 12 hs hasta el día esperado de la ovulación. Finalmente, previo al momento esperado de la ovulación (día 18), se realizaron ovariectomías bilaterales por flanco izquierdo. A continuación, se aspiró el líquido folicular (LF) y se guardó a -80ºC para determinaciones hormonales (estradiol, progesterona, cortisol y testosterona). Además, se obtuvo una muestra de pared del folículo preovulatorio de cada animal de los grupos control y tratado con ACTH y se guardó a -80ºC para posteriores ensayos como se detalla a continuación. Y el resto de los ovarios se acondicionaron y procesaros hasta su inclusión en parafina.Cada muestra de pared folicular se dividió en porciones de aproximadamente 10-15 mg cada una. Sobre una porción se realizó extracción de ARN utilizando la técnica de Trizol (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones. A continuación, se realizó la transcripción reversa para obtener ADN copia (cDNA) utilizando la enzima Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase (MMLV-RT, Life Technologies) y se determinó la concentración de cDNA de cada muestra usando el espectrofotómetro UV/Vis (SPECTROStar Nano). Se llevaron a cabo las PCR en tiempo real utilizando cebadores de secuencias específicas para los genes MC2R y MRAP, y en un equipo QuantStudio QS3 (Applied Biosystem).Otra porción de cada muestra, se trató con inhibidor de proteasas (Pierce Protease Inhibitor Tablets, Thermo Fisher Scientific) y buffer RIPA, y se disgregó con ayuda de un homogeneizador de tejido (Ultra Turrax® IKA T10 Basic), para obtener las proteínas totales. A continuación, se determinó la concentración proteica utilizando la técnica analítica de Lowry modificado y un espectrofotómetro UV/Vis (SPECTROStar Nano, BMG LABTECH). Se realizó electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, sembrando 40 μg de proteínas por calle. Se realizó la transferencia a membranas de nitrocelulosa, para luego realizar la técnica western blot con los anticuerpos primarios específicos MC2R (LETH) y MRAP (AbCam).Se repitieron estos procedimientos para todas las muestras de pared folicular provenientes de los animales controles y tratados con ACTH.Mediante PCR en tiempo real se evidenció la expresión génica del MC2R y de MRAP en las muestras de pared folicular completa obtenidas de los ovarios de los animales controles y tratados con ACTH. Por western blot, se obtuvo una banda a 33 KDa correspondiente a la proteína MC2R en las muestras evaluadas. Además, se detectó una mayor concentración de cortisol en el LF del grupo tratado con ACTH en relación al grupo control (p