Capacidad de diferentes cepas de Staphylococcus aureus de adherirse, persistir y dañar células epiteliales mamarias bovinas

RENNA MS; SACCO SC; CALVINHO LF; DALLARD BE; BECCARIA C

La Plata

Otro; XI Reunión de Patología Veterinaria (RAPAVE). 12o Seminario dela Fundación C.L. Davis ? S.W. Thompson en Argentina.; 2018

FCV-UNLP

Staphylococcus aureus es el patógeno mayor más frecuentemente aislado de casos de mastitis bovina, tanto en Argentina, como en otros países. Si bien las infecciones intramamarias (IIM) por S. aureus tienden a ser subclínicas y crónicas, se ha evidenciado la presencia de cepas con mayor adaptación a la glándula mamaria, asociadas con IIM persistentes (P) y cepas con menor adaptación, asociadas con IIM transitorias (T). S. aureus es una bacteria extracelular, que puede invadir y sobrevivir dentro de células fagocíticas y epiteliales mamarias protegiéndose de la respuesta inmune del hospedador y de los tratamientos antibióticos. Estudios recientes han demostrado la asociación entre genotipos y factores de virulencia de S. aureus con las manifestaciones clínicas y el comportamiento epidemiológico de las IIM causadas por este microorganismo. El objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad de diferentes cepas de S. aureus para adherirse, persistir intracelularmente e inducir daño en una línea de células epiteliales mamarias bovinas transformadas (MAC-T). Se seleccionaron 2 cepas en función de su origen clínico (IIM T o P), genotipo, fenotipo y capacidad de internalización en las MAC-T. La cepa 806 (T), positiva para los genes cap8, icaACD, agrII y negativa para bap y blaZ, fuerte productora de biofilm, complejo clonal ST350 y de baja capacidad de invasión en las MAC-T. La cepa 5011 (P), positiva para cap5, icaACD, agrI, blaZ y negativa para bap, débil productora de biofilm, complejo clonal CC188 y de alta capacidad de invasión. Se infectaron las MAC-T con las cepas T y P. Se evaluó la adherencia utilizando una multiplicidad de infección (MOI) de 100 bacterias por célula y se determinó el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por ml adheridas a las MAC-T. La persistencia se evaluó con una MOI de 30 y se determinaron las UFC/ml intracelulares a las 4, 10, 24, 48 y 72 hs post-infección (pi). Para investigar la supervivencia de las bacterias en las MAC-T, las cepas se tiñeron con SYTO 9 e Ioduro de Propidio y los resultados se evaluaron por microscopía de fluorescencia. La muerte celular (por apoptosis o necrosis) inducida en las MAC-T (4, 24, 48 y 72 hs pi) se determinó por citometría de flujo utilizando Anexina V-FITC junto a Ioduro de Propidio. La viabilidad y proliferación de las MAC-T infectadas se evaluó mediante un kit de proliferación celular (XTT) por espectrofotometría. Los resultados demostraron que las cepas difirieron en su capacidad de adherirse a las MAC-T (P=0,001), con un número mayor de UFC/ml recuperadas de la cepa P (4,27x106 ± 1,95x106) con respecto a la T (3,41x105 ± 1,92x105). Respecto a la persistencia intracelular, la cepa P mostró mayor capacidad para sobrevivir en las MAC-T, recuperándose UFC hasta 72 hs pi. El número máximo de UFC/ml recuperadas para la cepa P fue a las 4 hs pi (6,53x104 ± 5,264) y disminuyó hasta las 72 hs pi. La cepa T sólo pudo recuperarse a las 4 hs pi (8,50x103 ± 5,0x102) con menos UFC/ml (P=0,002) en comparación con la cepa P. Se pudo observar la presencia de bacterias vivas intracitoplasmáticas positivas a SYTO 9 en las MAC-T infectadas con la cepa P a las 4, 10, 24, 48 y 72 hs pi. Las células infectadas con la cepa T sólo presentaron bacterias positivas a SYTO 9 a las 4 hs pi. La muerte celular fue por apoptosis para ambas cepas y en todos los tiempos evaluados. A las 24 hs pi ambas cepas indujeron los mayores porcentajes de apoptosis (P