ICIVET-LITORAL   24728
INSTITUTO DE CIENCIAS VETERINARIAS DEL LITORAL
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Utilización de Lactobacillus reuteri DSPV002C para la inhibición in vitro de Campylobacter termotolerantes aislados de cerdos
Autor/es:
ZIMMERMANN, JORGE A.; SIRINI, NOELÍ; SOTO, LORENA; BERISVIL, AYELÉN PATRICIA; OLIVERO, CAROLINA; FUSARI, MARCIA; ROMERO SCHARPEN, ANALÍA
Lugar:
Casilda
Reunión:
Jornada; XVIII Jornadas de Divulgación Técnico-Científicas 2017. Facultad de Ciencias Veterinarias; 2017
Institución organizadora:
Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional de Rosario
Resumen:
La gran mayoría de los aislamientos de Campylobacter provenientes de cerdos son Campylobacter coli, el cual es un importante patógeno transmitido por los alimentos, al igual que Campylobacter jejuni3. Además, los cerdos son criados en grupos, lo que puede facilitar la propagación del agente. Debido a esto, es prioritario la búsqueda de estrategias pre-matanza para disminuir la incidencia de estos patógenos zoonóticos en la cadena agroalimentaria. Una posible herramienta, es la implementación de bacterias ácido lácticas (BAL) con propiedades probióticas. En este trabajo se evaluó la inhibición producida por Lactobacillus reuteri DSPV002C (L. reuteri DSPV002C) frente a 5 Campylobacter coli aislados de cerdos.Las cepas de Campylocater coli estudiadas fueron: C567; C568; C569; C570 y C571. Las mismas pertenecen al cepario del Departamento de Salud Pública de la Facultad de Ciencias Veterinarias- UNL y presentan perfiles diferentes de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). El estudio de inhibición se realizó mediante la técnica de difusión en agar2. Las placas con las distintas cepas de Campylobacter se prepararon de la siguiente manera: se activaron mediante siembra en placa por estría en agar Desoxicolato-Cefoperazona-Carbón modificado (mCCDA) y fueron incubadas durante 48 h en jarras de anaerobiosis con un ambiente micro-aerofílico. Luego se prepararon suspensiones microbianas en soluciones de Ringer-lactato con una concentración de 107 UFC/ml de Campylobacter a partir de las placas de agar mCCDA. Para llevar la suspensión microbiana a dicha concentración se utilizó la escala de Mc Farlan (patrón N° 0,5). Las suspensiones se sembraron en superficie mediante agotamiento en placas de Mueller Hinton Agar. Se perforaron pocillos de 5 mm en el agar con cilindros de vidrio estériles. Para la preparación del extracto libre de células (ELC), L. reuteri DSPV002C se cultivó en caldo De Man, Rogosa y Sharpe (MRS) a 37 °C durante 24 h en aerobiosis. Se centrifugó el cultivo y el sobrenadante se dividió en ELC neutralizado (ELCn, con ajuste del sobrenadante libre de células a pH 7,0 con NaOH 3 N) y ELC sin neutralizar (ELCsn). Se sembraron 25µl de cada ELC en los pocillos de las placas con Campylobacter coli. Se utilizó ácido láctico diluido a ¼ como control positivo de formación de halo. Las placas se incubaron durante 24 h a 42 °C en condiciones de micro-aerofilia (H2:85%, CO2:10%, O2:5%). Luego de la incubación, se observó la presencia o ausencia de inhibición alrededor de cada pocillo. Cada determinación fue realizada por triplicado.Luego, para determinar si el efecto inhibitorio fue causado por sustancias proteicas (tipo bacteriocinas) se realizó una prueba de inhibición de Campylobacter coli con ELC tratados con proteinasa k sobre las cepas que provocaron inhibición luego de la neutralización del ELC. El sobrenadante de un cultivo over night de L. reuteri DSPV002C se neutralizó a pH 7,0 con NaOH 3 N. Posteriormente, al ELC se le agregó proteinasa K (1 mg/ml) y se calentó 60 minutos a 37°C para la desnaturalización proteica e incremento de la actividad enzimática1. Estos ELC fueron sembrados en las placas con C567 y C568. Las placas fueron incubadas durante 48 hs en ambiente micro-aerofílico a 42 °C. Se observó la presencia o ausencia de inhibición alrededor de cada pocillo. Como control positivo se utilizó el ELCnSe observó efecto antagónico del ELCsn para todas las cepas de C. coli. El ELCn de L. reuteri DSPV002C inhibió el crecimiento de C567 y C568, pudiéndose determinar que el efecto de inhibición no lo causó el ácido. Los ELC tratados con proteinasa k no produjeron halos. Este resultado indica que la inhibición la produjo una sustancia proteica, ya que luego de la acción de la proteinasa k, la misma perdió el efecto. Ésta podría ser una sustancia tipo bacteriocina. Se necesitarían realizar otros estudios para determinar fehacientemente su naturaleza. La cepa L. reuteri presenta probada actividad probiótica en ensayos in-vivo e in-vitro, por lo cual podría ser utilizada como una herramienta útil para reducir la presencia de Campylobacter en las granjas de producción porcina.BIBLIOGRAFÍA:1.Alvano, H.; Todorov, V.; Van Reenen, C.; Hogg, T.; Dicks, L.; Teixeira, P. (2007). Characterization of two bacteriocins produced by Pediococcus acidilactici isolated from ?Alheira?, a fermented sausage tradicionally produced in Portugal. International Journal of Food Microbiology. 116, 239-247.2.Harvey, A. (2000). Strategies for Discovering Drugs from Previously Unexplored Natural Products. Drug Discovery. 5, 7. 3.Tam, C.C.; O?Brien, S.J.; Adak, G.K.; Meakins, S.M.; Frost, J.A. (2003). Campylobacter coli ? an important foodborne pathogen. Journal of Infection. 47, 28-32.