Desarrollo de biomasa y método de detección de Escherichia coli Nissle 1917 para su utilización en un ensayo in vivo

ROMERO SCHARPEN, A.; ROSSLER, E.; LORENZÓN, G.; SIGNORINI, M.L.; ZIMMERMANN, J.A.; FRIZZO, L.S.; BERISIVIL, A.P.; FUSARI, M.L.; FUHR, E.M.; MARTÍ, L.E.; SOTO, L.P.; ZBRUN, M. V.; BLAJMAN, J.E.; ASTESANA, D.M.; ROSMINI, M.R.; SEQUEIRA, G.J.

Casilda

Jornada; XVII Jornadas de Divulgación Técnico-Científicas 2016. Facultad de Ciencias Veterinarias. IV Jornada Latinoamericana II Jornadas de Ciencia y Tecnología 2016. Facultad de Ciencias Agrarias.; 2016

Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional de Rosario

Escherichia coli Nissle 1917 (EcN, serotipo O6:K5:H1) es una cepa que puede habitar el tracto gastrointestinal de humanos y animales, sin provocarle daño alguno. Ha sido usada como agente probiótico para tratar infecciones gastrointestinales humanas desde 1920. Esta cepa carece de los genes de virulencia presentes en otras cepas de E. coli y es mucho más eficiente en la colonización del intestino humano, debido a sus fimbrias tipo F1C2. EcN presenta actividad antagónica in vitro contra Salmonella spp., Shigella ssp., algunos enteropatógenos como E. coli, Proteus spp. y Candida spp. También se conoce que desplaza a E. coli, Salmonella typhimurium y Candida albicans in vivo. Además la cepa estimula la respuesta inmune contra infecciones bacterianas y fúngicas in vivo4. Esta bacteria ha sido evaluada contra la diarrea neonatal en terneros en Alemania, observándose una reducción significativa. Estos estudios derivaron en la comercialización de la cepa bajo el nombre de Ponsocol®. Aunque este producto está disponible para veterinarios y productores como una droga de profilaxis para diarreas neonatales en Alemania, no es comercializado en nuestro país. Ante la falta de investigación de los efectos de este probiótico en terneros en Argentina, se planteó la realización de un ensayo in vivo donde estos animales serán alimentados con leche en alimentadores automáticos. Esta misma leche se utilizará para hacer crecer el microorganismo probiótico y evaluar sus efectos, haciendo el proceso más económico, al evitar la fermentación previa. El uso de alimentadores automáticos en el ensayo in vivo permitirá no solo ajustar, sino conocer los consumos individuales de los terneros, tanto de leche fermentada con probióticos como del alimento sólido. Además, se requiere de una técnica de monitoreo de la cepa, luego del paso por el tracto gastrointestinal. Aunque los métodos microbiológicos convencionales tales como métodos bioquímicos, fenotípicos y genotípicos para la identificación son fiables, se requieren varios días para obtener un resultado. El uso de la PCR implica ahorro de tiempo y se considera un método sensible para la detección de especies microbianas. En el caso de EcN la técnica más utilizada es la diseñada por Blum-Oehler y col. (2003)1. Esta herramienta no solo permite identificar la cepa a partir de cultivos puros, sino también desde muestras complejas. Esta PCR múltiple amplifica segmentos de pequeños plásmidos estables presentes en EcN que codifican para una proteína de membrana que interviene en la movilización, siendo específica para esta bacteria. El objetivo de este trabajo fue evaluar el crecimiento de EcN en leche y determinar la capacidad de discriminación de un método de detección específico para EcN. Para lograr los objetivos, EcN se reactivó en Eosin Methylen Blue agar (EMB) y se incubó a 37ºC durante 24 h. Una colonia de esta placa se repicó a un tubo con 9 ml de leche en polvo estéril (120g/l, pH 7,01). Este tubo se incubó a 37ºC durante 24 h en aerobiosis. EcN fermentó la leche (pH 5,40), obteniéndose una consistencia similar al yogurt a las 18 h de incubación. Se realizaron diluciones decimales seriadas en Ringer ¼ y se sembraron 6 placas en profundidad y 6 placas en superficie de Violet Red Bile Lactose agar (VRBL). Tres placas sembradas en profundidad y 3 en superficie se incubaron a 37ºC y las otras 6 placas a 44ºC durante 24 h. Se obtuvieron 8,7 y 8,8 logaritmos en las placas sembradas en profundidad y 8,7 y 8,9 en las placas sembradas en superficie incubadas a 37ºC y 44ºC respectivamente. Para poder ejercer su efecto, se debería administrar al menos 1 x 108 UFC/ml de este microorganismo viable4. Según Sezonov et al. (2007)3 esta bacteria crece 5x107 UFC/ml en medios líquidos comerciales específicos (caldo Luria Bertani). Macroscópicamente, en las placas sembradas en profundidad se observaron dos tipos de colonias (violetas pequeñas y rosadas más grandes), lo que pudo deberse a que algunas colonias crecieron a mayor profundidad que otras. En las placas sembradas en superficie las colonias crecieron uniformemente. Las colonias crecidas en superficie fueron identificadas por PCR. Para esto, se extrajo ADN por hervido (10 min a 100ºC). Se utilizaron tres pares de primers: MUTA 5 y MUTA6 (dirigidos a una región no codificante del plásmido pMUT1 -entre 1934 y 2276-, generando un producto de 361 pares de bases), MUTA 7 y MUTA 8 (región no codificante entre los genes mobA y repA -5302 y 4888-, generando un producto de 427 pb) y MUTA9 y MUTA 10 (región blanco mobBD -46 y 340-, producto de 313 pb). El programa de ciclado utilizado fue un paso de desnaturalización de 3 min a 95ºC, seguido de 35 ciclos de tres pasos de 45s cada uno a 95ºC (desnaturalización), 60ºC (annealing) y 72ºC (extensión). Por último la extensión final fue de 3 min a 72ºC. Los productos de esta PCR fueron sometidos a una electroforesis en gel de agarosa al 1%. Se utilizaron controles negativos (E. coli aislada desde sangre, Salmonella spp. y Lactobacillus spp.). La presencia de los tres productos de PCR en el gel confirmó la identidad de EcN. Los controles negativos no generaron productos de PCR apreciables en el gel de agarosa. Se concluye que la leche en polvo es una buena matriz para el crecimiento de esta bacteria