Evaluación de la localización folicular del receptor de la hormona del crecimiento en ovarios bovinos

MARELLI, B.E.; DURANTE, L.I:; ORTEGA, H.H.; LEIVA, C.J.

Santa Fe

Encuentro; XX ENCUENTRO DE JÓVENES INVESTIGADORES; 2016

UNL

INTRODUCCIÓN Laeficiencia productiva en bovinos de carne y leche se basa en la obtención debuenos índices reproductivos con altas tasas de fertilidad y bajos intervalosparto-parto. Sin embargo, para lograr altas tasas de concepción, las vacasdeben reanudar su ciclicidad ovárica, tener una involución uterina normal, serdetectadas en estro, e inseminadas lo más rápido posible luego del parto. Laperformance reproductiva de cada vaca afecta la eficiencia de producción deleche o carne en el rodeo, por su influencia en el intervalo parto-primerservicio, parto-parto, duración de la lactancia y porcentaje de reposición.Parael establecimiento de la dominancia folicular y la consecuente ovulación, esnecesaria una adecuada cooperación entre factores hormonales y metabólicos.Esto se exacerba en el posparto inmediato, donde las demandas metabólicas de lalactancia compiten con las de la reproducción. En este contexto, aunque losejes somatotrófico y gonadotrófico han sido relacionados entre sí durante elcrecimiento y la maduración sexual, el rol de la hormona de crecimiento (GH) enla reproducción generalmente ha sido considerado como poco relevante (Ogilvy-Stuarty Shalet, 1992). Sin embargo, pueden encontrarse en la literatura trabajos quedemuestran que la GH afecta directamente la esteroideogénesis, gametogénesis ydiferenciación gonadal, así como la secreción de gonadotrofinas y la capacidadde respuesta a las mismas (Perez-Ibave et al., 2014). Asimismo, ha sido descriptoque el ovario es un sitio de acción directa de la GH (Katz et al., 1993), y lapresencia de su receptor ha sido reportada hace tiempo en diferentescomponentes foliculares (Lucy et al., 1993, Izadyar et al., 1999). Además,mientras que estas acciones pueden reflejar roles endocrinos de la GHhipofisaria, también pueden estar relacionadas a funciones paracrinas yautocrinas, ya que se ha demostrado la expresión del ARNm de GH en tejidosreproductivos de diferentes especies (Hull y Harvey, 2000; Silva et al., 2009),incluyendo el ovario bovino (Izadyar et al., 1999).Porlo tanto, considerando las funciones de la GH y su estrecha asociación con lafisiología ovárica, planteamos como hipótesis general que una alteración en susmecanismos de acción intraováricos, podría afectar el restablecimiento de laactividad ovárica favoreciendo además el desarrollo de ciertos trastornosreproductivos como la enfermedad quística ovárica (EQO).      OBJETIVOS Evaluarmediante la técnica de inmunohistoquímica indirecta (IHQ) la localización delreceptor de la hormona del crecimiento (GHR) en folículos ováricos bovinos endiferentes estadios de desarrollo. METODOLOGÍA Animales utilizados Parael desarrollo de este estudio se utilizaron ovarios obtenidos a partir de vacasHolando Argentino (n=3) con ciclos estrales regulares de acuerdo a la detecciónprevia del estro, palpación rectal y ultrasonografía. Los ciclos estrales dedichos animales fueron sincronizados utilizando el protocolo G6G-Ovsynch. Elinicio del estro fue confirmado por examen rectal y ultrasonografía y designadocomo día cero del ciclo. Adicionalmente se obtuvieron ovarios de vacas HolandoArgentino en playa de faena de frigoríficos (n=3), seleccionando aquellos deanimales no preñados, sin cuerpo lúteo activo, y sin evidencias de patologíasen el sistema reproductivo.  Protocolo de sincronización Elprotocolo G6G-Ovsynch en los animales a campo, consiste en una administraciónde prostaglandina F2α (PGF2α) y la aplicación, 2 días después, de una dosis dehormona liberadora de gonadotropinas (GnRH) que distará por 6 días de laadministración de GnRH del protocolo Ovsynch (día 0). Dicho protocolo continúa conuna aplicación de PGF2α al día 7, y finalmente otra dosis de GnRH al día 9(Bello et al., 2006). Se observó el comportamiento de los animales 24 h despuésde la última administración de GnRH para detectar el inicio del celo. Asimismo,la ovulación fue confirmada mediante ultrasonografía y designada como día 1 delciclo estral. Durante la sincronización se realizó el seguimiento de losanimales por ultrasonografía utilizando un equipo con un transductortransrectal de doble frecuencia de onda (5.0-7.5Mhz) (Chisson 8300 Digital,China) de acuerdo a la técnica descripta por Siriois y Fortune (1988). Lasimágenes fueron almacenadas y utilizadas para efectuar las mediciones de lasestructura foliculares ováricas.  Obtención de las muestras ováricas Losovarios fueron obtenidos en playa de faena o removidos por ovariectomíatransvaginal bajo anestesia epidural de acuerdo a técnicas descriptaspreviamente por nuestro grupo de trabajo (Marelli et al., 2014). En el caso deanimales a campo, previo a la castración, los folículos dominantes fueronaspirados. El líquido folicular (LF) obtenido fue refrigerado inmediatamentehasta su arribo al laboratorio donde fue conservado a -80ºC hasta suprocesamiento para la obtención de células foliculares y la realización de lasdeterminaciones hormonales. Antes del procesamiento, los ovarios fueronfotografiados para registrar su tamaño y realizar una descripción detallada delas estructuras foliculares encontradas. Por otra parte, los ovarios fueron fijadosen formol bufferado al 10% y procesados mediante técnicas histológicas derutina hasta su inclusión en parafina. Finalmente, se realizaron corteshistológicos coloreados con hematoxilina-eosina para una caracterizaciónmorfológica inicial. También se almacenaron muestras de tejidos a -80ºC paraser analizadas por western blot.  Detección del receptor de la hormonadel crecimiento en muestras de ovarios bovinos Western blot  Estatécnica se utilizó a los fines de evaluar la especificidad del anticuerpoanti-GHR (anti- human growth hormone receptor antibody ab202964, Abcam) enmuestras de pared folicular completa. Para ello se procesaron entre 60-80 mg detejido en buffer RIPA (RadioInmunoPrecipitation Assay) con inhibidores deproteasas utilizando un homogeinizador manual UltraTurrax® T25 Basic. Elhomogenato fue centrifugado y el sobrenadante, conteniendo los extractosproteicos totales, fue recuperado. La concentración de proteínas totales fuedeterminada mediante el método colorimétrico de Lowry (Lowry et al., 1951). Dichosextractos fueron analizados mediante electroforesis en geles de poliacrilamidaen condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), sembrando 40 μg de proteínas totalespor calle. A continuación, las proteínas separadas fueron transferidas a unamembrana de nitrocelulosa (GE) para realizar la inmunodetección con elanticuerpo anti-GHR (1:5000) mencionado anteriormente. La banda inmunoreactivacorrespondiente al GHR fue evidenciada utilizando un anticuerpo secundarioconjugado con peroxidasa (GE Healthcare) y la reacción fue visualizada mediantequimioluminiscencia (ECL Plus, GE Healthcare). Inmuhistoquímicaindirecta Secciones histológicas de ovarios bovinos fueronanalizadas por IHQ con el propósito evaluar la expresión del GHR. Para ello seutilizó el método de estreptavidina-biotina-peroxidasa que se describe acontinuación. En primer lugar, los cortes histológicos fueron desparafinados yse realizó una recuperación antigénica leve mediante el tratamiento de losmismos en microondas en buffer citrato de sodio 0,01 M (pH=6,0). La actividadde la peroxidasa endógena fue inhibida con H2O2 al 3%(vol/vol) en metanol, y las uniones no específicas fueron bloqueadas con sueronormal de cabra al 10% (vol/vol). Los cortes fueron incubados con el anticuerpoprimario anti-GHR mencionado en el ítem anterior en una dilución 1:100 durante18 h a 4ºC. Luego de lavar, los cortes fueron incubados con el anticuerposecundario 1:100 (Goat anti-rabbit IgG-B biotin conjugated, Santa Cruz) durante30 min a temperatura ambiente. Los antígenos fueron visualizados con estreptavidina-biotina(CytoScanHRP Detection System, Cell Marque) y 3,3-diaminobencidina (2-ComponentDAB Pack, BioGenex) como cromógeno. Finalmente, los cortes fueron lavados enagua destilada, contracoloreados con hematoxilina, deshidratados, y montados.Las imágenes microscópicas fueron digitalizadas con cámara Nikon DS‐Fi2 montada en un microscopio convencional (Nikon Eclipse Ni), utilizandoobjetivos de 4X y 40X.  RESULTADOS Medianteel análisis por western blot de muestras de tejido de pared completa defolículos de ovarios bovinos se observó una única banda inmunoreactiva de 110-120kDa correspondiente al receptor de membrana GHR. Estos resultados permitieronconfirmar la especificad del anticuerpo primario anti-GHR previo a suutilización en ensayos de IHQ. Porotra parte, mediante la técnica de IHQ se evidenció una marcación homogénea yabundante en células de la granulosa de las estructuras foliculares más pequeñascomo ser folículos primordiales, de transición, y primarios. Mientras tanto, losfolículos en estadios de desarrollo más avanzados como son preantrales yantrales, así como los atrésicos presentan una clara marcación en células de lateca, no observada en las estructuras pequeñas. CONCLUSIONES Losresultados obtenidos demuestran una localización diferencial del GHR en lasdistintas estructuras foliculares analizadas. En este sentido, se evidenció unaintensa marcación del receptor en células de la granulosa de folículos en losprimeros estadios de desarrollo y en células de teca en estadios más avanzados.Considerando que GH cumple un rol importante durante la dinámica folicularestimulando la proliferación de las células foliculares en diferentes etapas,podemos inferir que las modificaciones en sus niveles de expresión pueden sereslabones fundamentales en la patogenia de enfermedades ováricas y en desequilibriosendócrinos.  BIBLIOGRAFÍABelloNM et al. 2006.Optimizing ovulation tofirst GnRH improved outcomes to each hormonal injection of ovsynch in lactatingdairy cows. J Dairy Sci, 89(9):3413-24.HullKL, Harvey S. 2000.Growth hormone: a reproductive endocrine-paracrine regulator? Reviews ofReproduction, 5: 175-182.IzadyarF et al. 1999. Messenger RNA Expressionand Protein Localization of Growth Hormone in Bovine Ovarian Tissue an inCumulus Oocyte Complexes (COCs) During In Vitro Maturation. 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