CARACTERIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL RECEPTOR DE LA HORMONA FOLÍCULOESTIMULANTE EN OVARIOS DE BOVINOS CON ENFERMEDAD QUÍSTICA OVÁRICA

FLORES BRUN, ROCÍO; MARELLI, B.E.; ORTEGA, H.H.

Santa Fe

Encuentro; XIX ENCUENTRO DE JÓVENES INVESTIGADORES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL; 2015

La ciclicidad reproductivadel bovino es un proceso complejo estrictamente regulado por el ejehipotálamo-hipofisario-gonadal, siendo las hormonas gonadotróficas(luteinizante (LH) y folículo-estimulante (FSH)) esenciales para la funciónovárica de ésta y otras especies. Dichas hormonas actúan regulando elcrecimiento y la maduración folicular, así como la esteroidogénesis, mediantela unión a sus receptores específicos localizados en la membrana plasmática de lascélulas del ovario (Nogueira y col, 2007; Nimz y col, 2009). El receptor de FSH(FSHR) se expresa en las células de la granulosa de los folículos preantralesprimarios y secundarios, así como en folículos antrales. Por su parte, laexpresión del receptor de LH (LHR) está confinada a las células de la teca en folículospreantrales y antrales, mientras que su expresión en células de la granulosasólo se observa en los folículos dominantes preovulatorios (Bao y Garverick, 1998).Laenfermedad quística ovárica bovina (COD, del inglés: Cystic Ovarian Disease) secaracteriza por la presencia de estructuras anovulatorias persistentes enausencia de cuerpo lúteo y ciclos estrales interrumpidos o anormales (Silvia ycol., 2002). Los quistes ováricos son uno de los desórdenes reproductivos másfrecuentes en el ganado bovino, responsables de cuantiosas pérdidas económicaspara la producción pecuaria debido al incremento en los intervalosparto-concepción y parto-parto (Peter, 2004). En vacas lecheras, la incidenciade la COD puede variar entre un 10 y un 13%, pero en algunos establecimientospuede alcanzar hasta un 30-40% (Cattaneo y col., 2014).La patogénesis de la CODtiene una etiología multifactorial que involucra factores genéticos,fenotípicos y ambientales. El entorno endócrino asociado con la formación y elmantenimiento de los quistes ováricos ha sido estudiado exhaustivamente y lahipótesis más aceptada está basada en una disfunción neuroendócrina del ejehipotálamico-hipofisario-gonadal (Vanholder y col., 2006). No obstante, se haestablecido que ciertos componentes intraováricos también se encuentraninvolucrados (Ortega y col, 2015). En este sentido, aunque la dinámica delcrecimiento folicular está bien caracterizada, los cambios moleculares queocurren dentro del folículo ovárico previo a la anovulación aún no son claros. Eneste proceso, las gonadotrofinas juegan un rol fundamental y se postula quealteraciones en los niveles de expresión de sus receptores puede ser un factorrelevante en el desarrollo de los quistes. Con el propósito dedilucidar los mecanismos que subyacen la COD, en el presente trabajo seevaluaron los cambios en el patrón de expresión proteico del FSHR en ovariosbovinos quísticos mediante la técnica de inmunohistoquímica indirecta.  OBJETIVOS Caracterizarmediante la técnica de inmuhistoquímica indirecta el patrón de expresión proteicadel FSHR en ovarios provenientes de animales controles sanos y de animales conquistes foliculares, procurando establecer variaciones asociadas a la COD. METODOLOGÍA Obtenciónde las muestras de ovarios             Loscasos de COD espontánea fueron diagnosticados durante los controlesreproductivos de rutina en rodeos lecheros, con la colaboración deprofesionales veterinarios en el área de influencia de la Facultad de CienciasVeterinarias (UNL), Esperanza - Santa Fe. Alteraciones en los ovarioscompatibles con la COD fueron verificadas por ultrasonografía (5 MHz lineartransducer, Honda HS101V). Como parámetros normales fueron considerados undiámetro medio de los folículos ovulatorios de 13-15 mm, una duración media delciclo estral de 20-21 días, y la presentación del comportamiento de celo el día19-21 del ciclo estral. Como estructuras quísticas fueron considerados todosaquellos folículos con un diámetro superior a 20 mm y que persistieron en eltiempo por 10 días o más, sin que se produzca la ovulación o la formación de uncuerpo lúteo (Silvia y col., 2002). Las muestras fueron obtenidas a partir devacas Holando Argentino que mostraron uno o más quistes foliculares. Losovarios fueron removidos por ovariectomía transvaginal bajo anestesia epidural deacuerdo a técnicas descriptas previamente por nuestro grupo (Marelli y col.,2014).            Losovarios normales controles fueron obtenidos a partir de vacas Holando Argentinocon ciclos estrales regulares de acuerdo a la detección previa del estro,palpación rectal y ultrasonografía. Los ciclos estrales de dichos animales fueronsincronizados utilizando el protocolo Ovsynch (Pursley y col., 1995). El iniciodel estro fue confirmado por examen rectal y ultrasonografía y designado comodía cero del ciclo. Los animales controles fue ovariectomizados cuando elfolículo dominante alcanzó un diámetro mayor a los 10 mm, en ausencia de uncuerpo lúteo activo. Evaluación de laexpresión proteica del FSHR mediante inmunohistoquímica indirecta Secciones histológicas de ovarios de animales con quistesfoliculares espontáneos (n=6) y animales controles sincronizados (n=6) fueronanalizados por inmunohistoquímica indirecta con el propósito localizar ycuantificar expresión de FSHR en células de la granulosa. Para ello se utilizó elmétodo de inmunoperoxidasa estreptavidina-biotina que se describe acontinuación. Luego de la desparafinación de los cortes de tejidos, se realizóla recuperación antigénica mediante el tratamiento de los mismos en olla apresión en buffer EDTA 1mM-Tween 0,05% (pH=8). La actividad de la peroxidasaendógena fue inhibida con H2O2 al 3% (vol/vol) enmetanol, y las uniones no específicas fueron bloquedas con suero normal decabra al 10% (vol/vol). Todas las secciones de tejido fueron incubadas con elanticuerpo policlonal anti-FSHR 1:2500 (producido en el Centro de MedicinaComparada ? IciVet-Litoral y purificado por cromatografía empleando una columnade proteína A) durante 18 h a 4 ºC. Luego de lavar, los cortes fueron incubadoscon el anticuerpo secundario 1:100 (Goat anti-rabbit IgG-B biotin conjugated,Santa Cruz) durante 30 min a temperatura ambiente. Los antígenos sevisualizaron con HRP estreptavidina Label (CytoScan sistema de detección deHRP, Cell Marque), y 3,3-diaminobencidina (Liquid DAB-Plus Kit de sustrato;Zymed) como cromógeno. Finalmente, los portaobjetos fueron lavados en aguadestilada, contracoloreados con hematoxilina, deshidratados, y montados. Lasimágenes microscópicas fueron digitalizadas con cámara video color (Motic 2000; Motic China Group)montada en un microscopio convencional (Olympus BH-2; Olympus Co), utilizandoobjetivos de 4X y 40X, y analizadas con el programa Image Pro-Plus 3.0.1 system(Media Cybernetics, Silver Spring).  RESULTADOS El patrón de expresión proteica delFSHR fue evaluada en muestras de tejido ovárico obtenidas a partir de animalessanos y animales con COD mediante la técnica de inmunohistoquímica indirecta.En ambos tipos de muestras se analizaron diferentes categorías foliculares:folículos primordiales (FP), folículos preantrales pequeños (FPP), folículospreantrales grandes (FPG), folículos antrales (FA) y folículos quísticos (FQ). Deesta manera, se evidenció una marcación positiva en las células de la granulosade todos los tipos foliculares analizados, y no así en las células de la teca. Como puede observarse en la Figura 1,se comprobó una mayor expresión del FSHR en los FA respecto del resto de lascategorías foliculares analizadas (p<0,05), así como una disminuciónsignificativa en los niveles de expresión de dicho receptor en quistes conrespecto a los folículos antrales de animales controles sanos (p<0,05). CONCLUSIONES A partir de los resultados obtenidos podemos concluir quela mayor expresión del FSHR ocurre en una etapa fundamental del desarrollofolicular, como es el reclutamiento cíclico, donde los folículos preantralescomienzan su crecimiento dependiente de gonadotrofinas. Por otra parte, los quistes foliculares exhibieron unpatrón de expresión proteica del FSHR disminuido en relación a los folículosantrales de ovarios de animales controles sanos. Este hecho evidenciaría unaposible alteración en el sistema de señalización de gonadotrofinas en laEnfermedad Quística Ovárica Bovina. BIBLIOGRAFÍA Bao B.,Garverick H., 1998. Expression ofsteroidogenic enzyme and gonadotropin receptor genes in bovine follicles duringovarian follicular waves: a review. J. Anim. Sci., 76, 1903-1921.Cattaneo L., Signorini M., Bertoli J.,Bartolomé J., Gareis N., Díaz P., Bo G., Ortega H., 2014. Epidemiological description of cystic ovarian disease in Argentine dairyherds: risk factors and effects on the reproductive performance of lactatingcows. Reprod.Domest. Anim., 49, 1028?1033. Marelli B.,Díaz P., Salvetti N., Rey F., Ortega H., 2014. mRNA expression pattern of gonadotropin receptors in bovine follicularcysts. Reprod. Biol., 14, 276?281.Nimz M.,Spitschak M., Schneider F., Fürbass R., Vanselow J., 2009. Down-regulation ofgenes encoding steroidogenic enzymes and hormone receptors in late preovulatoryfollicles of the cow coincides with an accumulation of intrafollicularsteroids. Domest. Anim. Endocrinol., 37(1), 45?54.Nogueira M.,Buratini J., Price C., Castilho A., Pinto M., Barros C., 2007. Expression of LH receptor mRNA splice variants in bovinegranulosa cells: changes with follicle size and regulation by FSH in vitro. Mol. Reprod. Dev., 74(6),680?686. Ortega H., Marelli B., Rey F., Amweg A., DíazP., Stangaferro M., Salvetti N., 2015. Molecular aspects of bovine cystic ovarian disease pathogenesis. Reproduction,149, R251?R264.Peter A., 2004. An update on cysticovarian degeneration in cattle. Reprod. Domest. Anim., 39, 1?7. Pursley J.,Mee M., Wiltbank M., 1995. Synchronization ofovulation in dairy cows using PGF2alpha and GnRH. Theriogenology, 44, 915-923.Silvia W.,Hatler T., A. M. Nugent A., Laranja D., Fonseca L., 2002. 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