Optimización de cultivos de células de la granulosa a partir de folículos ováricos bovinos

AMWEG AN; RODRÍGUEZ FM; MARELLI BE; GAREIS NC; SALVETTI NR; ORTEGA HH; REY F

Jornada; III Jornada de difusión de la investigación y extensión; 2015

FCV-UNL

La proliferación de las células de la granulosa desempeña un roldeterminante en la foliculogénesis. Las gonadotropinas y los estrógenos son losprincipales moduladores del crecimiento celular durante el periodopreovulatorio1. El cultivo de células de granulosa bovina ha sido ampliamenteutilizado desarrollándose diferentes sistemas in vitro para la evaluación de laregulación fisiológica del crecimiento folicular y la ovulación, entre otrosprocesos2. Las células de la granulosa bovina son capaces de proliferar invitro en presencia de diferentes factores de crecimiento y en presencia oausencia de suero fetal bovino. En este sentido, una combinación adecuada defactores de crecimiento y hormonas serían suficientes para promover a lascélulas a ingresar a la fase de síntesis (S) de ciclo celular1.Debido a la necesidad de evaluar la respuesta de dichas células frentea diferentes estímulos hormonales o analizar diversos componentesintracelulares que no pueden ser estudiados in vivo dado la complejidad de lossistemas, en este trabajo nos propusimos optimizar el cultivo primario de lascélulas de la granulosa a partir de folículos ováricos bovinos.Para ello, se realizaron ensayos con muestras de ovarios obtenidas enplaya de faena provenientes de animales sin signos aparentes de trastornosreproductivos que fueron transportadas al laboratorio en solución fisiológica a35ºC. Una vez allí, los ovarios fueron lavados con solución fisiológicapreviamente acondicionada en baño termostático a 35°C. Se seleccionaronfolículos con diámetro mayor a 8mm provenientes de ovarios sin alteracionesmacroscópicas visibles y se realizaron diferentes pooles de 6 folículos comomáximo. Se realizó la punción de dichos folículos con agujas 21G y se extrajoel líquido folicular que fue almacenado a -80°C para su posterior análisishormonal. Se realizaron lavados suaves con buffer fosfato salino (PBS) estérilsuplementado con antibiótico-antimicótico (penicilina- streptomicina-anfoterinica- fungizona, Gibco), para desprender las células de la granulosa.El producto del lavado fue centrifugado por 5 minutos a 500g. Se descartó elsobrenadante y el pellet de células fue lavado con PBS estéril y centrifugadoen las mismas condiciones. A continuación, se procedió a la eliminación de loseritrocitos mediante el uso de un buffer de lisis (EDTA-Na2 0,1mM, NH4Cl 0,15M,KHCO3 1mM). Finalmente, las células se resuspendieron en 1ml de medio decultivo DMEM:F12 (MV) suplementado con albúmina sérica bovina (0,1%, BSA,Felasa), FSH, 1ng/ml, insulina, 0,01ng/ml y antibiótico- antimicótico, 0,1%. Serealizó el recuento celular en cámara de Neubauer utilizando el método deexclusión del Trypan blue. Para cada ensayo se sembraron 100.000 células viables/pocillo paraensayar las siguientes condiciones: 1- Control basal (células sin estímulos);2- Células estimuladas con testosterona, 100ng/ml.Luego de incubar durante 48hs a 37°C en atmosfera con 5% CO2, serealizó el estímulo correspondiente y se mantuvieron en las mismas condicionespor 72hs. Una vez que las células llegaron a confluencia, las células sinestímulo, se resuspendieron en el reactivo comercial Trizol (Invitrogen) y serealizó la extracción de ARN siguiendo las instrucciones del fabricante. Luegose trató con ADNasa y se realizó la transcripción reversa para obtener ADNc.Finalmente se analizaron los niveles de la enzima citocromo P450 aromatasa(CYP19a1) enzima característica de las células de la granulosa encargada dearomatizar andrógenos, mediante un protocolo optimizado de reacción en cadenade la polimerasa (PCR). Paralelamente, se evaluó la enzima citocromo P450 17hidroxilasa/ 17, 20 liasa (CYP17a1) característica de las células de la tecapara descartar contaminación cruzada con esta población celular. Por otro lado, las células estimuladas con testosterona fueronresuspendidas en un buffer RIPA para su posterior extracción de proteínas yanálisis del receptor de FSH (RFSH) mediante western blot. Para el análisis proteico se realizó una corrida electroforética en ungel desnaturalizante de poliacrilamida al 12%. Las proteínas fueron trasferidasa una membrana de nitrocelulosa y luego se realizó el western blot con unanticuerpo policlonal específico anti-RFSH desarrollado en el Centro deMedicina Comparada (CMC- ICiVet Litoral, UNL-CONICET).Los sobrenadantes de los cultivos se almacenaron a -80°C para futurasdeterminaciones hormonales.Las células de la granulosa obtenidas en este ensayo mantuvieron suviabilidad y morfología en las condiciones de cultivo establecidas durante eltiempo del ensayo.Los resultados evidenciaron expresión génica de la enzima CYP19a1 entodos los pooles evaluados sin observarse la expresión génica de CYP17a1, queconfirmaría la pureza de la población de células en cultivo. Por otro lado, mediante el ensayo de western blot se evidenció unabanda específica de 30KDa de peso molecular correspondiente al RFSH, y cuyaexpresión se incrementó en presencia del agente estimulante respecto alcontrol. Estos resultados preliminares indicarían que el método de obtención decélulas de la granulosa a partir de folículos ováricos bovinos podría serutilizado para futuros ensayos que contribuirían a comprender los mecanismosrelacionados a la esteroidogénesis, la ovulación y los procesos relacionados ala funcionalidad ovárica.