Evaluación de diferentes suplementos en un sistema de cultivo de células de la granulosa bovinas

RODRÍGUEZ FM; SALVETTI NR; ORTEGA HH; REY F

Jornada; II Jornada de difusión de la investigación y extensión.; 2014

La proliferación de las células de la granulosa es un componente fundamental en el desarrollo del folículo ovárico. Las células de la granulosa aisladas de diferentes especies muestran diferencias considerables en la habilidad de proliferar in vitro. Se ha demostrado que estas células, obtenidas de folículos ováricos bovinos y porcinos, son capaces de proliferar in vitro en presencia de diferentes factores de crecimiento y en presencia o ausencia de suero fetal bovino1. El cultivo de células de granulosa bovinas ha sido ampliamente estudiado y se han desarrollado diferentes sistemas in vitro para la evaluación de la regulación fisiológica del crecimiento folicular y la ovulación, entre otros procesos3. Actualmente, el medio de cultivo utilizado incorpora hormona folículo-estimulante (FSH) e insulina para aumentar la esteroidogénesis y lograr un crecimiento eficaz manteniendo las células sin luteinizarse2. Sin embargo, el uso de estos suplementos debe limitarse cuando se requiere evaluar el efecto del estímulo de FSH, de hormona luteinizante (LH) o de insulina sobre la funcionalidad de las células de la granulosa. El objetivo de nuestro trabajo fue evaluar diferentes suplementos en un medio de cultivo para células de la granulosa bovinas que permitan el crecimiento y mantenimiento prolongado de las mismas. Para ello, se realizaron ensayos con muestras de ovarios obtenidas en playa de faena. Una vez en el laboratorio los ovarios fueron lavados con solución fisiológica previamente acondicionada en baño termostático a 35°C. Se seleccionaron 6 folículos con características coincidentes con las de folículos preovulatorios (diámetro mayor a 8mm provenientes de ovarios sin CL o con un CL de diámetro menor a 3mm). Se realizó la punción de dichos folículos con agujas 18G y se extrajo el líquido folicular que fue almacenado a -80°C para su posterior análisis hormonal. Se realizaron lavados suaves con buffer fosfato salino (PBS) estéril para desprender las células de la granulosa. El producto del lavado fue centrifugado a 500g por 5 minutos. Se descartó el sobrenadante y el pellet de células fue lavado con PBS estéril y centrifugado. Finalmente, las células se resuspendieron en 2ml de medio de cultivo DMEM:F12 y se filtraron utilizando una malla de acero de 150µm. Se realizó el recuento celular en cámara de Neubauer utilizando el método de exclusión del Trypan blue. Para cada ensayo se sembraron 50.000 células viables/pocillo para ensayar las siguientes condiciones del medio de cultivo: 1- DMEM:F12 con 1ng/ml de FSH y 0,01ng/ml de insulina, 2- DMEM:F12 con 4ng/ml de Selenio y 2,5ug/ml de transferrina, 3- DMEM:F12 con Selenio (4ng/ml), transferrina (2,5ug/ml) e insulina (0,01ng/ml) y 4-DMEM:F12 sin suplementos. Se incubaron por 24, 48 y 72 horas a 39°C en atmosfera con 5% CO2 y se realizaron recuentos celulares a las 24 y 72 horas. El recuento a las 24 horas evidenció para el medio de cultivo 1: 2,65 105 células vivas/pocillo; para el medio de cultivo 2 1,4 105 células vivas/pocillo; para el 3: 3,15 105 células vivas/pocillo y para el 4: 5,2 105 células vivas/pocillo. Por el contrario, el recuento a las 72 horas para la condición 1 fue: 7,7 105 células vivas/pocillo, para 3- 1,58 106 células vivas/pocillo y para 4- 1,56 106 células vivas/pocillo. El sobrenadante del cultivo se destinó a mediciones hormonales y las células se resuspendieron en el reactivo comercial Trizol (Invitrogen) para la posterior extracción de ARN. Se realizó una retrotranscipción con la tecnología iScript y finalmente se analizaron los niveles de la enzima aromatasa (CYP19), enzima característica expresada por células de la granulosa encargada de aromatizar andrógenos, mediante PCR en tiempo real. Como gen de referencia para la cuantificación relativa se utilizó gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH).