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La proliferación de las células de la granulosa desempeña un rol importante en el desarrollo de la foliculogénesis ovárica. Las gonadotropinas y los estrógenos son los principales moduladores del crecimiento celular durante el periodo preovulatorio. Se ha demostrado que las células de la granulosa obtenidas de folículos ováricos bovinos y porcinos son capaces de proliferar in vitro en presencia de diferentes factores de crecimiento y en presencia o ausencia de suero fetal bovino. En este sentido, una combinación adecuada de factores de crecimiento y hormonas serían suficientes para promover a las células a ingresar a la fase de síntesis (S) de ciclo celular1. El cultivo de células de granulosa bovina ha sido ampliamente estudiado y se han desarrollado diferentes sistemas in vitro para la evaluación de la regulación fisiológica del crecimiento folicular y la ovulación, entre otros procesos3. El sistema de cultivo para células de la granulosa utilizado actualmente en diferentes trabajos incorpora hormona folículoestimulante (FSH) e insulina para lograr un crecimiento eficaz y mantener las células sin luteinizar2. Si bien dicho medio de cultivo es eficiente, su uso se limita para estudios de estímulos hormonales. Debido a esto, el objetivo de nuestro trabajo fue desarrollar un sistema de cultivo in vitro para células de la granulosa bovina que permita el crecimiento y mantenimiento prolongado de las mismas para su posterior estudio frente a estímulos hormonales de FSH, hormona luteinizante (LH) e insulina. Se realizaron 2 ensayos para los que se utilizaron muestras de ovarios obtenidas en playa de faena a las cuales se le realizaron sucesivos lavados con solución fisiológica previamente acondicionadas en baño termostático a 35°C. Los folículos seleccionados presentaron características coincidentes con las de folículos preovulatorios (diámetro mayor a 8cm provenientes de ovarios sin cuerpo lúteo o con un cuerpo lúteo de diámetro menor a 3cm). Se descartaron los folículos que presentaron características de atresia. Se realizó la punción folicular con agujas 18G de 6 folículos dominantes y se extrajo el líquido folicular que fue almacenado a -80°C para su posterior análisis hormonal. Se realizaron lavados suaves con buffer fosfato salino (PBS) estéril para desprender las células de la granulosa. El producto del lavado fue centrifugado a 500g por 5 minutos. Se descartó el sobrenadante y el pellet de células fue lavado con PBS estéril y centrifugado. Finalmente, las células se resuspendieron en 2ml de medio de cultivo DMEM:F12 y se filtraron utilizando una malla de acero de 150µm. Se realizó un recuento celular en cámara de Neubauer utilizando el método de exclusión del Trypan blue. El recuento para un ensayo fue 3,03 106 células vivas y 1,2 106 para otro. Para cada ensayo se sembraron 50.000 células vivas/pocillo para ensayar las siguientes condiciones del medio de cultivo: 1- DMEM:F12 con 1ng/ml de FSH y 0,01ng/ml de insulina, 2- DMEM:F12 con 4ng/ml de Selenio y 2,5ug/ml de transferrina, 3- DMEM:F12 con Selenio (4ng/ml), transferrina (2,5ug/ml) e insulina (0,01ng/ml) y 4DMEM:F12 sin suplementos. Se incubaron por 24, 48 y 72 horas a 39°C en atmosfera con 5% CO2. Las condiciones de temperatura fueron optimizadas en ensayos anteriores. Se realizaron recuentos celulares a las 24 y 72 horas. El recuento a las 24 horas evidenció para el medio de cultivo 1: 2,65 105 células vivas/pocillo; para el medio de cultivo 2 1,4 105 células vivas/pocillo; para el 3: 3,15 105 células vivas/pocillo y para el 4: 5,2 105 células vivas/pocillo. Por el contrario, el recuento a las 72 horas para la condición 1 fue: 7,7 105 células vivas/pocillo, para 3- 1,58 106 células vivas/pocillo y para 4- 1,56 106 células vivas/pocillo. El medio de cultivo se destinó a mediciones hormonales y las células se resuspendieron en el reactivo comercial Trizol (Invitrogen) para la posterior extracción de ARN. Se realizó una retrotranscipción con la tecnología iScript y finalmente se analizaron los niveles de la enzima aromatasa (CYP19), enzima característica expresada por células de la granulosa encargada de aromatizar andrógenos, mediante PCR en tiempo real. Como gen de referencia para la cuantificación relativa se utilizó gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Los resultados evidenciaron una mayor expresión de la enzima CYP19 en el medio de cultivo compuesto por selenio y transferrina. Además, este medio mostró la mayor proliferación celular a las 72 horas. Por otro lado, al analizar los niveles hormonales, se pudo observar una alta relación de estrógenos/ progesterona en este medio, lo que evidenciaría un crecimiento de las células de la granulosa a las 72 horas sin luteinizarse. Estos resultados podrían evidenciar que el medio de cultivo suplementado con transferrina (2,5ug/ml) y selenio (4ng/ml), podría sustituir al medio actualmente utilizado en el estudio in vitro de células de la granulosa frente a estímulos hormonales en tiempos prolongados.