Monitoreo de Lactobacillus salivarius DSPV 001 de origen aviar mediante electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante

BLAJMAN J.E.; FUSARI M.; ASTESANA D.M.; BERISVIL A.; ROMERO SCHARPEN A.; CONTI G.; SOTO, L.P.; ZBRUN, M. V.; SIGNORINI, M.L.; FRIZZO, L.S.

Córdoba

Jornada; XV Jornadas Argentinas de Microbiología; 2014

La electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) es una técnica molecular utilizada para identificar microorganismos dominantes en comunidades microbianas complejas. La técnica se basa en la migración de moléculas de ADN a través de geles de poliacrilamida que contienen concentraciones crecientes de agentes desnaturalizantes, lo que da lugar a un patrón de bandas que refleja la diversidad genética presente en la comunidad microbiana. El objetivo del presente trabajo fue monitorear la cepa Lactobacillus salivarius DSPV 001P de origen aviar con propiedades probióticas empleando DGGE. Para el ensayo fueron utilizados 2 pollos parrilleros de 1 día de vida. Uno de los pollos recibió una dosis diaria de L. salivarius DSPV 001P de 1x109 UFC por vía oral durante 5 días, mientras que en el pollo restante la cepa fue administrada en el agua de bebida (1x109 UFC). Los pollos fueron luego sacrificados mediante dislocación cervical. Se realizaron hisopados cloacales y se tomaron muestras de ciego. A partir de estas muestras se extrajo ADN empleando el kit comercial Wizard® Genomic DNA Purification. Las muestras fueron amplificadas empleando los primers universales GC-HDA1f y HDA2r que amplifican la región V2-V3 del gen del ARNr 16S. El programa de amplificación empleado fue: 4,5 min de desnaturalización, 30 ciclos de 94 °C por 30 s, 58 °C por 30 s y 68 °C por 1 min; y elongación final a 68 °C por 7 min. Las muestras se sembraron en geles de poliacrilamida 8 % p/v en buffer TAE. Se incluyó en el gel una calle con el producto de amplificación de L. salivarius DSPV 001P a fin de analizar si podía detectarse la colonización intestinal de esta bacteria. La separación óptima de las bandas se alcanzó empleando gradientes desnaturalizantes urea-formamida 30-55 %. La electroforesis se llevó a cabo a 130 V (voltaje constante) durante 4 h a 60 °C. Los geles se tiñeron y visualizaron bajo luz UV. La técnica DGGE permitió identificar en las muestras provenientes de ciego de ambos pollos una banda ubicada en la misma posición que la cepa L. salivarius DSPV 001P. Sin embargo, dicha banda no pudo ser visualizada en las muestras provenientes de hisopados cloacales, lo que podría deberse a una menor cantidad de microorganismos a nivel de la cloaca y a una menor recuperación de muestras por el método de hisopado. La comparación de la posición de las bandas con aquellas generadas por cepas de referencia resulta de utilidad para determinar presencia o ausencia de los microorganismos de interés. Por otro lado, los diferentes perfiles generados, permiten hacer una primera comparación de comunidades entre los dos pollos estudiados. Además deja abierta la posibilidad, que mediante la secuenciación de las bandas generadas, se determine la composición de la microbiota cultivable y no cultivable de pollos parrilleros que reciben un tratamiento con probióticos, en relación a pollos parrilleros de un grupo control.