Efecto de los componentes del medio de cultivo en la producción de sustancias tipo bacteriocinas

ASTESANA, DIEGO; BLAJMAN, JESICA E.; FUSARI, MARCIA L.; BERISVIL, AYELÉN P.; FRIZZO, LAUREANO S.; SOTO, LORENA P. ; ZBRUN, MARIA VIRGINIA; SEQUEIRA, GABRIEL ; SIGNORINI, MARCELO L. ; ROSMINI, MARCELO

Casilda

Jornada; XV Jornadas de divulgación técnico-cientifícas en ciencias veterinarias; 2014

Facultad de ciencias veterinarias UNR

Las bacteriocinas son proteínas o péptidos producidos por algunas bacterias que por lo general producen inhibición sobre bacterias que están estrechamente relacionadas con la cepa productora 2. Los  componentes  del medio de cultivo pueden  influir  modificando la producción de bacterocinas por parte  de las  bacterias ácido lácticas  (BAL).  El propósito de éste trabajo fue evaluar la producción de  sustancias inhibitorias tipo  bacteriocinas utilizando diferentes  medios de cultivo, en donde variaba la composición de sus componentes principales. Para llevar a cabo el trabajo se utilizaron los medios,  TGE (Caldo Triptona Glucosa)  modificado, CGB (Caldo Caseína Glucosa)  y MRS (de  Man, Rogosa y Sharpe)  con diferentes modificaciones. La composición del TGE  modificado  fue  Proteosa  Peptona  1  %, Glucosa 1%,  Extracto de levadura  1%,  Sulfato de magnesio  0,005%,  Sulfato de manganeso  0,005%,  Agar  1,5%,  Tween  80  0,1%,  pH  6,8.    La composición de CGB fue Proteosa Peptona 2 %, Glucosa 1%, Extracto de levadura 0,5%, Citrato de amonio  0,2%,  Fosfato di sódico  0,2%,  Sulfato de magnesio 0,01%, Sulfato de manganeso  0,005%, Agar  1,5%, Tween 80  0,1%, pH  6,8. La composición del MRS fue  Peptona  1%,  Glucosa 2%, Extracto de levadura  0,4%,  Extracto de carne  0,8%,  Acetato de sodio  0,5%,  Citrato  de amonio 0,2%,  Fosfato dipotásico 0,2%,  Sulfato de magnesio  0,02%, Sulfato de manganeso 0,005%,  Tween 80  0,1%,  pH  6.5.  Además se  modificó la fuente de carbono del MRS reemplazándose por maltosa (MRS1) y sacarosa (MRS2).  También se  utilizó MRS sin  tween 80  (MRS3).  Las cepas que se utilizaron forman parte del cepario del Laboratorio de Alimentos del Departamento de Salud Pública, FCV, UNL y  fueron aisladas de  la microbiota intestinal de terneros  jóvenes. Las cepas con  actividad antimicrobiana en estudio fueron  Pediococcus acidilactici  DSPV 66T,  P. acidilactici DSPV 69T  Lactobacillus plantarum DSPV 106T 1. La cepa tapiz utilizada fue  Enterococcus faecium  DSPV 22T.  Las bacterias fueron descongeladas y sembradas  en placas de medio MRS  y se incubaron a 37°C durante 48 a 72h.  La técnica de difusión en agar se utilizó para determinar la producción de  sustancias inhibitorias tipo  bacteriocinas.  Para esto  se tomó una colonia  de la placa,  se repicó en 4ml de  caldo de los diferentes medios y se incubó a 37°C durante 16h. Luego se repicó en tubos falcon con 10ml de caldo de los diferentes medios y se incubó a 37ºC a 16h. Posteriormente se procedió a centrifugar para extraer el sobrenadante o extracto libre de células (ELC). A continuación se modificó el pH, agregando hidróxido de sodio 3M, llevándolo a un valor entre los 6 y 6,5 para obtener el ELC neutralizado (ELCN). Los ELCN se esterilizaron por filtración y se conservaron en freezer  a  -20°C hasta su  utilización. Posteriormente sobre una placa que contenía 10 ml de medio MRS sólido se adicionaron 8ml de medio MRS semisólido que previamente se inoculó con 40 µl de un cultivo fresco (overnight) de la cepa indicadora. Se dejó solidificar y se realizaron hoyos de 5mm de diámetro donde se depositaron 25 µl del ELCN. Las placas se llevaron a 5°C durante una hora para permitir que los ELCN puedan difundir a través del agar. Después se incubaron  las placas en estufa a 37°C durante 24  h  y se observó la presencia  o ausencia de zonas de inhibición de crecimiento bacteriano.  Todas las determinaciones se realizaron por triplicado.  Para la cepa  P.  acidilactici  DSPV 66T  se observaron halos de 2mm de diámetro  y  para la cepa  P. acidilactici DSPV 69T  se observaron halos de 2,5mm de diámetro en todos los medios con la excepción de MRS1  y MRS 2  donde no aparecieron halos en dos de las tres réplicas. Para la cepa  L.  plantarum  DSPV 106T  se observaron halos de 1,5mm  en las tres réplicas de los  medios  TGE,  CGB, MRS1  y  MRS2,  pero sólo manifestó halo  en una de las replica  en MRS. La ausencia de tween 80 no modificó  la producción de  sustancias tipo  bacteriocinas.  Si bien  resulta dificultoso establecer si alguno de los  medios mostró  mayor producción de sustancias antimicrobianas,  en  los medios CGB, MRS1  y MRS2  las cepas produjeron las sustancias inhibitorias en forma más constante y predecible y por lo tanto podrían ser de elección en los trabajos futuros sobre producción de las sustancias para su purificación.