Participación del TGFbeta1 en la patogenia de la Enfermedad Quística Ovárica en Bovinos.

MATILLER V; STANGAFERRO ML; PANZANI CG; REY F; ORTEGA HH; SALVETTI NR

Casilda

Jornada; XIV Jornadas de Divulgación Técnico-Científicas 2013 de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de Rosario.; 2013

Facultad de Ciencias Veterinarias. UNR

Los miembros de la Superfamilia del Factor de crecimiento Transformante-β (TGF-β) tienen una amplia influencia en muchos tejidos y sistemas orgánicos incluyendo el ovario. Las moléculas de señalización intracelular de la esta Superfamilia comprenden más de 30 proteínas funcionalmente diversas pero estructuralmente relacionadas que incluyen, en mamíferos, tres isoformas de TGF-β (TGF-β 1, 2, 3). Estas moléculas de señalización tienen una importante función tanto autocrina como paracrina en la regulación del crecimiento y la fisiología ovárica. TGFβ1 es expresada principalmente en células de la granulosa de folículos bovinos pequeños1 y dentro de sus funciones en estas células se encuentran la inhibición de  luteinización y promoción de la apoptosis, y al actuar de esta manera, podría tener un papel fisiológico para controlar la proliferación y diferenciación de las células de la granulosa y podría estar implicado en la selección del folículo dominante. Está demostrado que este factor de crecimiento ejerce un papel inhibitorio en el desarrollo del folículo. Por otro lado, la Enfermedad Quística Ovárica (COD, del inglés Cystic Ovarian Disease) es un desorden frecuentemente encontrado en vacas lecheras que puede afectar hasta un 15% de los animales durante el período posparto, prolongando el intervalo parto- concepción y provocando pérdidas significativas a la producción pecuaria en general. Demostrada la importancia de TGFβ1, nos planteamos que su expresión podría estar alterada en ovarios de bovinos con COD diagnosticados a campo y en un modelo experimental de Inducción a la enfermedad. Se trabajó con secciones de ovarios bovinos: 1) con COD espontánea, 2) con COD inducida mediante la administración de ACTH y 3) controles provenientes de animales sanos. Se trabajó con secciones de ovarios obtenidos de hembras bovinas con COD espontanea e inducida (n=8, para cada grupo), confirmado mediante tacto rectal y ultrasonografía; y con ovarios controles (n=8) provenientes de animales sanos en proestro. Los ovarios fueron obtenidos mediante ovariectomía. Las muestras fueron fijadas en formaldehído bufferado al 4% durante 8 hs a 4° C y procesadas de acuerdo a técnicas histológicas de rutina hasta la inclusión en parafina. Luego se efectuaron cortes seriados de 4 µm de espesor sobre los que se realizó una técnica de inmunohistoquímica indirecta2 para la determinación de TGFβ1 (anticuerpo primario policlonal, Santa Cruz Biotechnology). Se utilizó un anticuerpo secundario biotinilado, luego extravidina-peroxidasa (Sigma), y finalmente la reacción fue revelada utilizando 3,3´diaminobencidina (Invitrogen) como cromógeno y hematoxilina activada como contra-coloración. Como control de la técnica se realizó la técnica como se detallada previamente pero se remplazó el anticuerpo primario por suero normal de cabra (reactivo de bloqueo de uniones inespecíficas). Se digitalizaron imágenes mediante un microscopio acoplado a una cámara digital. Se tomaron imágenes de folículos primarios, secundarios, terciarios y atrésicos de ambos grupos y quísticos de animales con la enfermedad. El análisis digital se realizó mediante el programa Image-Pro Plus 3.0.1 (Media Cybernetic). Se midió el % de área inmunomarcada para cada capa folicular y los resultados obtenidos se analizaron estadísticamente con el programa SPSS para Windows 11.0.1. Se realizaron dos tipos de análisis, por un lado se compararon las categorías foliculares entre los diferentes grupos para determinar si en cada una de las categorías había diferencias; y por otra parte se realizó un análisis a lo largo de la foliculogénesis dentro de cada grupo. Además, se realizó la comparación de los quistes inducidos y espontáneos en relación a los folículos terciarios y atrésicos del grupo control. Las diferencias fueron detectadas mediante el test de Duncan. Se observó una mayor marcación citoplasmática en las células de la granulosa que en las células de la teca. Se encontraron diferencias significativas (p<0,05) para los quistes entre los grupos espontáneos e inducidos siendo mayor la marcación en el primero de estos. Cuando se realizó la comparación para una misma categoría entre grupos no se encontraron diferencias en la granulosa para folículos primarios (controles: 9,12+/-2,90; COD inducida: 12,65+/-1,67; COD espontánea: 14,00+/-6,97), secundarios (controles: 13,55 +/-4,59; COD inducida: 14,18+/-1,16; COD espontánea: 13,45 +/- 4,2), terciarios (controles:  8,73 +/-3,75; COD inducida: 8,94+/-2,16; COD espontánea: 10,77+/-4,29) y atrésicos (controles: 6,49+/-1,31; COD inducida: 8,74+/-1,64; COD espontánea: 7,91+/-2,54). Sin embargo, cuando se compararon los valores de folículos terciarios (8,73 +/-3,75) y atrésicos (6,49+/-1,31) del grupo control con los quistes espontáneos (20,37+/-11,53) e inducidos (10,42+/-1,42) pudo observarse un aumento significativo en la expresión de esta proteína en los quistes espontáneos. Por otra parte en la la teca interna se encontraron algunas diferencias en la expresión de TGF-β1en folículos terciarios (controles: 8,12+/-1,60; COD inducida: 5,03+/-1,48; COD espontánea: 5,98+/-2,40) no así en folículos atrésicos (control: 4,70+/-0,61; COD inducida: 4,52+/-1,11; grupo COD espontánea: 3,15+/-1,61). Los quistes mostraron diferencias entre sí entre espontáneos e inducidos y en relación a los folículos terciarios y atrésicos del grupo control (espontáneos: 10,61+/-4,41; inducidos: 4,65+/-0,64). Considerando las múltiples funciones de la TGFβ1 en el ovario dentro de las que se puede destacar su papel inhibitorio en el desarrollo folicular, así como la disminución de los niveles de proliferación de las células de la granulosa y la estimulación de la diferenciación celular, es probable que su expresión aumentada en los quistes foliculares esté relacionada con la persistencia en el tiempo de las estructuras quísticas. BIBLIOGRAFÍA: 1-Nilsson, E.E.; Doraiswamy, V.; Skinner, M.K..Transforming growth factor beta isoform expression during bovine ovarian antral follicle development.Mol Reprod Dev 66:237-246, 2003. 2-Salvetti, N.R.; Stangaferro, M.L., Palomar, M.M.; Alfaro, N.S.; Rey, F.; Gimeno, E.J.; Ortega, H.H.. Cell proliferation and survival mechanisms underlying the abnormal persistence of follicular cysts in bovines with cystic ovarian disease induced by ACTH. Anim Re