Comparación de técnicas para la detección de bacteriocinas.

ASTESANA, D.M.; BLAJMAN, J.E.; FUSARI, M.L.; FRIZZO, L.E.; SOTO, L.P; ZBRUN, M.V.; SEQUEIRA, G.J.; SIGNORINI, M.L.; ROSMINI, M.R.

Casilda

Jornada; Jornada Nacional de Divulgación Técnico Científico 2013; 2013

Facultad de Ciencias Veterinarias-Universidad Nacional de Rosario

Las bacteriocinas son proteínas o péptidos producidos por algunas bacterias que por lo general producen inhibición sobre bacterias que están estrechamente relacionadas con la cepa productora1. Varios son los métodos que han sido utilizados para determinar la presencia de las sustancias inhibitorias de microorganismos. El objetivo de éste trabajo fue comparar la sensibilidad de tres técnicas para detectar la presencia de las bacteriocinas. Las técnicas que se compararon fueron la difusión en agar, mota en césped y microtitulación. Las cepas que se utilizaron forman parte del cepario del Laboratorio de Alimentos del Departamento de Salud Pública, FCV, UNL y pertenecen a la microbiota intestinal de terneros jóvenes. Las cepas con probable actividad antimicrobiana en estudio fueron Pediococcus acidilactici DSPV 66T y P. acidilactici DSPV 69T. La cepa tapiz utilizada fue Enterococcus faecium DSPV 22T. Las bacterias fueron descongeladas y repicadas en placas de medio MRS (Man, Rogosa y Sharpe) y se incubaron a 37°C durante 48 a 72hs. Para realizar la técnica de difusión en agar se tomó una colonia y se repicó en 10 ml de medio MRS y se incubó a 37°C durante 16hs. Posteriormente se procedió a centrifugar para extraer el sobrenadante o extracto libre de células (ELC). A continuación se modificó el pH, agregando hidróxido de sodio 3M, llevándolo a un valor entre los 6 y 6,5 para obtener el ELC neutralizado (ELCN). Los ELCN se esterilizaron por filtración y se conservaron en freezer -20°C hasta su utilización. Posteriormente sobre una placa que contenía 10 ml de medio MRS sólido se adicionaron 8 ml de medio MRS semisólido que previamente se inoculó con 40 µl de un cultivo fresco (overnight) de la cepa indicadora. Se dejó solidificar y se realizaron hoyos de 5mm de diámetro donde se depositaron 25 µl del ELCN. Las placas se llevaron a 5°C durante una hora para permitir que los ELCN puedan difundir a través del Agar. Después se incubó las placas en estufa a 37°C durante 16hs y se observó la presencia o ausencia de zonas de inhibición de crecimiento bacteriano. Todas las determinaciones se hicieron por triplicado. Para la técnica de mota en césped2 se utilizaron los cultivos overnight de las cepas. Se prepararon placas de medio MRS sólido sobre las cuales se sembraron 5 a 10 µL de cada cultivo activo de las cepas en estudio. Las placas se dispusieron bajo flujo laminar por 30 min para permitir la absorción del cultivo y posteriormente se las incubó en estufa a 37°C durante 24 h. Luego se inocularon 10 mL de agar MRS fundidos en tubo con 40 µL de un cultivo fresco de la cepa indicadora. Se cubrieron las colonias de las cepas productoras con éste medio y se incubaron nuevamente las placas a 37 °C durante 24 hs. Se observaron las placas en busca de presencia o ausencia de zonas de inhibición de crecimiento bacteriano. Todas las determinaciones se hicieron por triplicado. Para la técnica de microtitulación se colocaron 20 µL de un cultivo overnight de la cepa indicadora en contacto con 100 µL de ELCN de las cepas en estudio. Se incubaron los tubos a 37°C durante 48 h. Se realizaron observaciones a las 12, 24, 36 y 48 h. Se observó la presencia o ausencia de turbidez en el medio de cultivo. Todas las determinaciones se hicieron por triplicado. Las dos cepas en estudio manifestaron producir sustancias antimicrobianas y se ha observado inhibición sobre la cepa tapiz en las tres técnicas utilizadas. Para la técnica de difusión en agar se puedo observar que P. acidilactici DSPV 66T produjo halos de 2 mm y P. acidilactici DSPV 69T produjo halos de 1 mm alrededor de los hoyos. Para el método de mota en césped, P. acidilactici DSPV 66T produjo halos de 5 mm y la P. acidilactici DSPV 69T produjo halos de 4 mm alrededor de las colonias. Para la técnica de microtitulación no se observó turbidez en los tubos de ambas cepas. En la técnica de mota en césped al utilizarse los cultivos frescos de las cepas, hay un gran número de bacterias crecen en un espacio reducido, donde habría una mayor competencia, lo que podría favorecer la producción de bacteriocinas. Sin embargo la producción de ácido por parte de las BAL podría inhibir el crecimiento de la cepa tapiz por lo que se confundiría con el efecto producido por las bacteriocinas. En los métodos de de difusión de agar y microtitulación, al trabajar con el ELCN el pH no afectaría el crecimiento. Sin embargo la presencia de agar puede disminuir el contacto de las bacteriocinas con la cepa tapiz, por impedimentos de difusión, lo que no ocurriría en el de método microtitulación ya que las bacteriocinas entran en contacto directo con las cepas. En conclusión las tres técnicas mostraron la presencia de sustancias antimicrobianas. Teniendo en cuenta las características de cada una de ellas y la información que brindan, la combinación de más de un método podría ser de interés para la detección de bacteriocinas.