Análisis de la activación y consecuente translocación del factor de transcripción nuclear (NF-κB) en glándula mamaria bovina inoculada con un compuesto inmunoestimulante

SILVESTRINI, P; DURE AB; ANDREOTTI CS; RENNA MS; ORTEGA HH; CALVINHO LF; DALLARD BE; BARAVALLE C

Casilda, Santa Fe

Jornada; XIV Jornadas de Divulgación Técnico-Científicas 2013 de la Facultad de Ciencias Veterinarias, UNR. Rosario; 2013

Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de Rosario

En nuestro laboratorio, se ha estudiado la utilización de extracto de  Panax ginseng (PG) al momento del secado como  una  alternativa  a  los  métodos  convencionales  de  control  de  las  infecciones  intramamarias  (IIM)  en  bovinos. Hasta  la  fecha,  los  resultados  obtenidos  han  demostrado  que  la  inoculación  intramamaria  (IM)  de  PG,  estimuló  de manera  significativa  la  expresión  de  citoquinas  proinflamatorias en  leche  y  en  tejido  mamario  durante  la  primera semana de la involución comportándose como un estimulante de las defensas innatas del huésped1. Los efectos del ginseng sobre la respuesta inmune han sido atribuidos a los ginsenósidos que incrementan la producción de citoquinas4; sin embargo, el mecanismo molecular que interviene en la producción no ha sido dilucidado. En estudios recientes, en cuartos mamarios tratados con PG, hemos observado una intensa inmunomarcación para TLR-2  y  TLR-4 en el epitelio secretor de la glándula mamaria y en células del sistema inmune. Además, los porcentajes de inmunomarcación y la expresión de ARNm para ambos receptores, se vieron significativamente aumentados en los tejidos provenientes de cuartos tratados con PG en comparación con los controles que no recibieron tratamiento2. En base a estos resultados se postula que los ginsenósidos u otros componentes de la raíz de PG inoculados  por  vía  IM  al  momento  del  secado  inducen  una estimulación de la respuesta inmune innata por parte del huésped a través de la liberación de citoquinas y que la misma estaría regulada por la activación de receptores tipo toll (TLR-2 y TLR-4). La cascada de señalización de los receptores tipo toll implica la activación de factores de transcripción nucleares, previa unión de moléculas adaptadoras como MyD88. El factor de transcripción nuclear-kappa B (NF-кB) es un complejo de proteínas homo o heterodiméricas donde el complejo p65-p50 es el más abundante. La activación de NF-кB, involucra la fosforilación y rápida degradación de la proteína inhibitoria (IκB) la cual lo mantiene secuestrado en el citoplasma. Luego de su activación el complejo proteico se transloca al núcleo, ejerciendo así la acción transcripcional de ciertos genes que involucran la síntesis y secreción de citoquinas proinflamatorias3.  En base a los antecedentes planteados, se propone como objetivo identificar y cuantificar células con NF-κB activo en tejido mamario proveniente de cuartos tratados con PG al momento del secado y cuartos controles sin tratamiento mediante inmunohistoquímica (IHQ). Para ello, se utilizaron 6 vacas Holstein con ubres clínicamente sanas. Luego del último ordeño, ocho cuartos fueron inoculados por vía IM con un extracto de PG (3 mg/ml), 6 fueron inoculados con placebo (solución fisiológica, 10 ml) y 6 fueron mantenidos sin inoculación (controles). A los 7 días post tratamiento, se extrajeron muestras de tejido mamario para la realización de IHQ utilizando un anticuerpo primario específico (anti-NF-κBp65, Santa Cruz Biotechnology). El sistema de revelado empleado fue el de estreptavidina-peroxidasa-DAB. La especificidad del anticuerpo primario utilizado en IHQ se corroboró mediante western blot en muestras de tejido mamario. NF-κB  activado fue detectado por la localización nuclear de p65 en células epiteliales y estromales de la glándula mamaria y se cuantificó utilizando el programa Image-Pro Plus 3.0.1.Sólo se consideraron como células positivas aquellas que mostraron tinción nuclear intensa y el resultado se expresó como porcentaje de células intensamente marcadas. Las diferencias estadísticas entre los tratamientos fueron analizadas mediante ANOVA seguido de un test de comparaciones múltiples (Duncan). El nivel de significancia utilizado fue de P<0.05. La inmunoexpresión de la proteína NF-κB p65, se asoció levemente al citoplasma de las células epiteliales y estromales (NF-κBp65 inactivo), mientras que una fuerte actividad se evidenció por la elevada marcación nuclear de  NF-κB p65 en ambos tipos celulares y en células inmunitarias presentes en la glándula. Los porcentajes de células positivas fueron mayores en cuartos tratados con PG con respecto a los controles, sin tratamiento, tanto en células epiteliales como estromales (p<0.05). En base a los resultados arrojados en el presente trabajo y tomados en conjunto con los anteriormente obtenidos, se podría concluir que el extracto de PG estimularía la activación de NFκB, jugando un papel predominante en la promoción y síntesis de citoquinas proinflamatorias y de otros mediadores por parte de las células mamarias e inmunitarias presentes en la glándula.   1- Baravalle, C.; Dallard, B.E.; Cadoche, M.C.; Pereyra, E.A.; Neder, V.E.; Ortega, H.H.; Calvinho, L.F. Proinflammatory cytokines and CD14 expression in mammary tissue of cows following intramammary inoculation of Panax ginseng at drying off. Vet Immunol Immunopathol.; 144,1-2:52-60, 2011. 2- Baravalle, C.; Dallard, B.E.; Cadoche, M.; Perrig, A.; Ortega, H.H.; Calvinho, L.F. Modificación de la expresión de TLR 4 en respuesta a la inoculación de un modificador de la respuesta biológica en glándula mamaria bovina. Presentado en ?III Jornadas y Reunión Anual de la Asociación Argentina de Inmunología Veterinaria?, 2010 3- Kawai T, Akira S. Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends Mol. Med. 13,11:460-469, 2007. 4- Smolina, T.V.; Soloveva, T.F.; Besednova, N.N. Immunotropic activity of panaxans-bioglycans isolated from ginseng. Antibiot Khimioter. 46, 7:19-22, 2001