Expresión del receptor tipo I del factor de crecimiento análogo a insulina en ovarios de animales con enfermedad quística ovárica bovina

COLOMBERO M; RODRÍGUEZ FM; AMWEG AN; PANZANI CG; BENÍTEZ G; ORTEGA HH; REY F

Jornada; XIV Jornadas de divulgación técnico-científicas 2013; 2013

La Enfermedad Quística Ovárica (COD) es una de las principales causas de disminución de la fertilidad en vacas lecheras. Ocasiona pérdidas significativas en la producción pecuaria dado que prolonga el intervalo entre partos y requiere costosos tratamientos. Se caracteriza por la persistencia de una estructura folicular anovulatoria (mayor a 20 mm) que provoca trastornos en la funcionalidad ovárica.Son numerosos los mecanismos que intervienen en el control del desarrollo folicular, entre ellos el sistema IGF.Dicho sistema está compuesto por dos ligandos (IGF1 e IGF2), 6 proteínas de unión (IGFBPs), IGFBP proteasas específicas y dos receptores (IGFR1 e IGFR2). El IGFR1 es un receptor de tipo tirosin-quinasa que se une con alta afinidad a IGF1 y en menor grado a IGF2. Debido a que IGF1 y sus receptores cumplen funciones determinantes en la regulación del desarrollo folicular, la hipótesis de este trabajo plantea que podrían ejercer un rol importante en la patogénesis de la COD. Es por ello que en este trabajo nos propusimos evaluar la expresión de mRNA de IGFR1 utilizando PCR en tiempo real. Se utilizaron folículos de ovarios bovinos controles y con la enfermedad obtenidos en playa de faena (n=11 para células de la granulosa y n=21 para células de la teca). Se realizó la extracción de RNA por el método de Trizol (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante, tratamiento con DNAsa y transcripción reversa en células de la granulosa y de la teca de manera de obtener cDNA. Se analizó la expresión génica de IGFR1 mediante un protocolo optimizado de PCR en un termociclador en tiempo real (Step One, Applied Biosystem) en ambas poblaciones celulares utilizando primers diseñados en nuestro laboratorio para tal fin. Se utilizó GAPDH como gen normalizador. El protocolo consiste en una desnaturalización inicial a 95ºC por 5 minutos, 38 ciclos de desnaturalización a 95ºC por 15 segundos y annealing a 58ºC (IGFR1) y 52ºC (GAPDH) por 20 segundos, extensión a 72ºC por 30 segundos y una lectura de fluorescencia a 82ºC (IGFR1) y 74ºC (GAPDH). Todas las mediciones se realizaron por duplicado. La eficiencia de las PCRs y la expresión relativa de mRNA para IGFR1 en cada muestra se determinaron con una curva estándar. La misma se construyó con diluciones seriadas de pooles de cDNA y la eficiencia de la PCR se calculó usando el software Step One v2.2. Para la amplificación se combinaron 4 µL de cDNA con una solución master mix conteniendo agua DEPC, buffer Taq 10X (Invitrogen), MgCl2 (50 mM), dNTPs (25 mM), primer sentido (20 µM), primer antisentido (20 µM), SYBR Green( 0.5 µM) y Taq polimerasa (2 U/25µl, Invitrogen), en un volumen final de 20µL. Las secuencias de los primers usados se describen en la Tabla I. Tabla I: Secuencias Forward (For) y Reverse (Rev) de primers utilizados. Primer Secuencia(5´-3´) Longitud (bp) GAPDH GAPDH For CAC CCT CAA GAT TGT CAG CA Rev GGT CAT AAG TCC CTC CAC GA 103 IGFR-1 IGFR-1 For CACGCCTTGGTCTCCTTGTCCT Rev CGTCACTTCCTCCATGCGGTAAAT 219 En todos los ensayos se incluyó un control negativo. Se cuantificó utilizando el método 2-deltadeltaCt. Las diferencias obtenidas se analizaron estadísticamente con el programa SPSS para Windows 11.0.1. Los resultados parciales mostraron una expresión de mRNA codificante para IGFR1 en ambas poblaciones celulares. En células de granulosa se observó un aumento (p<0,05) de la expresión génica con el crecimiento folicular y una disminución en folículos quísticos (p<0,05) respecto a folículos controles de mayor tamaño. No hubo diferencias significativas en la expresión de mRNA de IGFR1 en células de la teca en todas las estructuras analizadas. Previamente en nuestro laboratorio se ha observado una disminución de la expresión de mRNA de IGF1 en células de la granulosa de quistes con respecto a folículos terciarios controles por hibridación in situ, como así también de la expresión proteica en líquido folicular y en células de la granulosa y teca. Probablemente la disminución génica del receptor puede estar relacionada a la menor expresión de su ligando. De esta manera, se podría inferir que IGF1 y su receptor, al modular el desarrollo folicular estarían participando en alteraciones relacionadas con la COD.06.