MÉTODOS Y CRITERIOS PARA VALIDAR Y COMPARAR APTÁMEROS O SECUENCIAS DE ADN EN SU UNIÓN A PROTEÍNAS ADHERIDAS A NITROCELULOSA EN FORMA NATIVA O DESNATURALIZADA.

ASENSIO, C.J.A.; MASSE EDERRA, C.; MASSIP COPIZ, M.M.; CLAUZURE, M.; VALDIVIESO, A.G.; SANTA COLOMA, T.A .

Mar del Plata

Congreso; LX REUNIÓN DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE INVESTIGACIÓN CLÍNICA (SAIC); 2015

SOCIEDAD ARGENTINA DE INVESTIGACIÓN CLÍNICA (SAIC)

Determinar cuali/cuantitativamente la unión del ADN a proteínasadheridas a nitrocelulosa y caracterizarla como específica sonobjetivos en las etapas de selección de aptámeros de ADN. Laespecificidad es importante cuando el blanco proteico de losaptámeros se debe detectar en una mezcla compleja de proteínas. Enla actualidad, pocos aptámeros de ADN han sido validados en suespecificidad en la presencia de mezclas complejas como esnecesario con los lisados celulares en south-western. Para facilitar lasmencionadas caracterizaciones ensayamos dos tipos de formato: a) eldot-blot para péptidos y proteínas nativas puras y b) el south-westernpara proteínas recombinantes desnaturalizadas y lisados. Establecercriterios y controles que permitan monitorear la eficacia de losprocesos de selección en estos formatos, ahorrando tiempo yesfuerzo, es un importante tema a desarrollar en el área. Paraidentificar y caracterizar la señal de fondo debida a la unióninespecífica con las proteínas utilizamos una batería deoligonucleótidos y librerías sintéticos de distinta longitud, secuencia yestructura secundaria o topología. Comparamos la unión a variasproteínas y lisados cuando dichos oligonucleótidos están en forma decadena simple o doble. También utilizamos como controles proteínaso péptidos que pegan ADN inespecíficamente por interacciónelectrostática u otro tipo de interacciones. Tuvimos en cuenta el efectode los buffers de unión, el pH y la concentración de iones como asítambién el tipo de bloqueante de la nitrocelulosa. Encontramos que losperfiles de proteínas que unen ADN varían de un tipo celular a otropero ciertas estrategias o criterios de selección son aplicables acualquiera y permiten ayudar a determinar si una proteína esseleccionable dentro de una mezcla compleja. También estudiamosproteínas catiónicas, que basalmente unen ADN, como caso extremode blanco proteico de aptámeros. Proponemos además un usoproteómico del ADN. AGRADECIMIENTOS UCA