DESARROLLO DE TÉCNICAS DE MARCACIÓN RADIOACTIVA IN VITRO PARA DETERMINAR PERFILES PROTEÓMICOS DIFERENCIALES Y BIOMARCADORES EN FRACCIONES CITOPLÁSMICAS DE MACRÓFAGOS INFECTADOS CON BACTERIAS O TRATADOS CON AGONISTAS DE RECEPTORES TIPO TOLL (TLRS)

CRISTIAN JORGE ALEJANDRO ASENSIO; RODOLFO C GARCÍA

Mar del Plata

Congreso; LIX REUNIÓN CIENTÍFICA ANUAL Sociedad Argentina de Investigación Clínica; 2014

SAIC

Es crucial encontrar biomarcadores proteicos intracelulares específicos de cada tipo de respuesta inmune innata. En macrófagos el compartimiento citoplásmico habitado por bacterias es el que sufre mayor número de alteraciones en su proteoma,vías de señalización, tráfico y arquitectura. Para encontrar dichos biomarcadores desarrollamos técnicas in vitro de marcación radioactiva de proteínas citoplásmicas en la línea de macrófagos humanos THP1, infectados o no con bacterias. Para ello realizamos reacciones de fosforilación y Nucleotidilación en presencia de las bases apropiadas marcadas con 32P. Los patrones marcados difieren según la reacción y base radioactiva utilizada incrementando las probabilidades de éxito. La marcación in vitro de fracciones aventaja la marcación metabólica por no alterar las vías de señalización y condiciones de cultivo. Las marcaciones permitieron detectar en forma cuantitativa, sensible y reproducible algunas proteínas no abundantes (difíciles de visualizar con las coloraciones Coomassie y argéntica). En las fracciones citosólica (S100), de membranas totales (P100) y de vesículas (fagosomas incluidos) encontramos perfiles proteicos marcados diferencialmente y biomarcadores debidos a infección y/o ligación de TLRs. En particular, caracterizamos un biomarcador que resulta siempre incrementado específicamente por la ligación del TLR2. Es el único existente para TLRs. Es una nueva variante postraduccional, citosólica de la chaperona HSPA5. Permite comparar y validar distintos ligandos del TLR2 (bacterianos o sintéticos) y caracterizar las consecuencias espacio-temporales de la ligación. Con nuestra técnica la sensibilidad de detección del biomarcador aumentó 20 veces respecto a la mejor coloración argéntica. Los resultados con los agonistas de TLR2 no se evidenciaron en la línea HeLa, carente de dicho receptor. Concluimos que sólo mediante esta técnica altamente sensible se caracteriza en macrófagos un biomarcador de ligación del TLR2