MÉTODOS FOSFOPROTEÓMICOS PARA DETERMINAR ACTIVIDADES QUINASA Y NUEVOS SUSTRATOS CELULARES EN FRACCIONES CITOPLÁSMICAS DE MACRÓFAGOS HUMANOS THP-1 UTILIZANDO PÉPTIDOS SUSTRATOS Y PROTEÍNAS ENDÓGENAS

CRISTIAN JORGE ALEJANDRO ASENSIO; RODOLFO C GARCÍA

Mar del Plata

Congreso; LIX REUNIÓN CIENTÍFICA ANUAL Sociedad Argentina de Investigación Clínica; 2014

SAIC

La fosfoproteómica mostró gran crecimiento en 20 años pero es aun necesario desarrollar técnicas. Sus objetivos son caracterizar nuevos substratos celulares de quinasas definiendo redes de interacción quinasa-substrato y consecuencias fisiopatológicas de las fosforilaciones. Utilizamos fracciones citoplásmicas (citosol/membranas) de la línea de macrófagos humanos THP1 para estudiar sus actividades quinasas en células infectadas con bacterias o no. Buscamos determinar actividades quinasa diferenciales entre tratamientos. Hipotéticamente también utilizar las quinasas endógenas para detectar radioactivamente proteínas citoplásmicas fosforilables y expresadas diferencialmente entre tratamientos. Optimizamos las condiciones de fosforilación in vitro (iv) de fracciones sin agregar quinasas exógenas. Determinamos las actividades quinasa endógenas utilizando péptidos exógenos por un lado y substratos endógenos por otro. Exploramos diferentes condiciones de fosforilación: buffer, pH, iones, sales, lípidos, inhibidores, fracciones puras o combinadas, y tipo de nucleótido marcado en Pgama (ATP/GTP). Para una misma muestra celular los patrones de proteínas fosforilables iv difirieron significativamente según la condición maximizando probabilidades de detectar nuevos substratos. También comparamos la marcación con 32P de proteínas endógenas debida a fosforilación con la debida a nucleotidilación (incorporación del Palfa desde un nucleótido) una PTM poco explorada en humanos. La infección alteró niveles de algunas proteínas fosforilables iv. Entre ellas, la nucleolina citosólica disminuida por la infección fue fosforilable por CK2 como otros reportaron, validando nuestros ensayos. La vimentina incrementada por la infección fue fosforilable por PKCs (como otros reportaron). Por otro lado, caracterizamos NUEVOS substratos: a) una nueva forma citosólica de Bip inducida tardíamente por infecciones y fosforilable por PKCs; b) otro substrato de CK2 inducido por infección,